Matériel PCR. réaction en chaîne par polymérase

Les méthodes modernes de recherche en laboratoire de haute technologie permettent d'identifier les maladies à un stade précoce. Les maladies infectieuses se développent et évoluent, elles deviennent de plus en plus nombreuses et il est de plus en plus difficile de les identifier. Le diagnostic par PCR (amplification en chaîne par polymérase) est l'un des plus récents et des plus précis. Pour son développement, le scientifique Kary Mullis a reçu le prix Nobel.

réaction en chaîne par polymérase- une méthode de diagnostic génétique moléculaire qui vous permet de trouver différents types de pathologies infectieuses et héréditaires chez les personnes, à la fois dans les formes aiguës et chroniques, et bien avant que la pathologie ne commence à se manifester. La plupart des médecins sont quotidiennement confrontés à cette analyse et n'imaginent plus comment il est possible de poser le bon diagnostic et le bon stade de la maladie sans elle.

L'essence du diagnostic PCR

L'analyse PCR utilise les principes de la biologie moléculaire. Lors de sa réalisation, des enzymes spéciales sont utilisées pour copier à plusieurs reprises des fragments d'ARN et d'ADN, ainsi que des micro-organismes qui provoquent des maladies et se trouvent dans du matériel biologique humain. La copie se produit en plusieurs étapes, de sorte qu'une réaction en chaîne se forme. Après cela, les spécialistes du laboratoire vérifient les données reçues avec une base de données commune et identifient les agents responsables de la maladie, ainsi que leur concentration. Le diagnostic est effectué dans un appareil spécial qui refroidit et chauffe un tube à essai avec un biomatériau et s'appelle un amplificateur. Le respect du régime de température affecte la véracité des résultats d'analyse.

Des fragments d'ADN de micro-organismes peuvent être contenus dans les matériels biologiques suivants :

• fluides biologiques;
• le sang et ses dérivés ;
• grattage des cellules épithéliales ou frottis ;
• urine;
• expectorations;
• mucus et autres sécrétions biologiques;
• biopathes de la membrane muqueuse du tractus gastro-intestinal.

Où est utilisé le diagnostic PCR ?

Les possibilités de diagnostic des maladies infectieuses à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase sont grandes ; elle peut être utilisée pour identifier une grande variété de virus qui causent des infections telles que :

Il ne s'agit pas d'une liste complète des maladies détectées par analyse PCR. La plupart de ces pathologies sont presque invisibles à un stade précoce, mais les conséquences de leur impact sur le corps sont extrêmement négatives et souvent dangereuses pour la santé et la vie humaines.

Les femmes enceintes se voient prescrire un test PCR pour détecter les infections sexuellement transmissibles, qui augmentent considérablement le risque de cancer du col de l'utérus, affectant négativement le déroulement de la grossesse et la santé de l'enfant. Par conséquent, le diagnostic des MST est extrêmement important afin de prévenir l'infection du fœtus par des micro-organismes pathogènes.

Sur la base de tout ce qui précède, nous pouvons conclure que les diagnostics de laboratoire utilisant la méthode PCR aident le médecin à établir un diagnostic précis et à prescrire un traitement efficace dans chaque cas individuel.

C'est intéressant! Outre la médecine, la méthode PCR est également utilisée dans d'autres domaines, par exemple en médecine légale, lorsqu'il est nécessaire d'identifier à qui appartient le biomatériau trouvé sur les lieux du crime, et parfois la PCR est utilisée pour déterminer la paternité, pour mener des expériences avec Mutation de l'ADN et autres expériences.

Avantages et inconvénients de la méthode

Les avantages du diagnostic PCR sont :

• la haute sensibilité du test permet de déterminer même des agents uniques de l'agent pathogène, ce qui permet de détecter une pathologie à un stade précoce, avec une forme chronique et latente;
• la polyvalence de la méthode permet l'utilisation de presque tous les biomatériaux pour la recherche, de la salive aux cellules de la peau ;
• large couverture - lors de l'examen d'un échantillon, il est possible de déterminer la présence de plusieurs agents pathogènes différents;
• précision - le haut niveau de cette méthode d'examen permet de ne pas donner de faux indicateurs;
• rapidité - le résultat est prêt en moyenne cinq heures, c'est-à-dire que le patient peut déjà prendre la conclusion le lendemain de la livraison du biomatériau;
• prix relativement bas - cette méthode de diagnostic ne diffère pas en coût des autres tests sanguins de laboratoire;
• en utilisant cette méthode, il est possible de faire des diagnostics précliniques et rétrospectifs. Le premier détecte les micro-organismes pathogènes avant même la manifestation de la maladie, et le second est effectué après le transfert de la pathologie, ce qui permet d'empêcher la pathologie de se développer et de la guérir à temps, ainsi que de déterminer le forme latente de la maladie qui survient sans symptômes évidents.

Mais les méthodes de diagnostic parfaites n'existent pas, par conséquent, la PCR présente des inconvénients :

• exigences élevées en matière de conformité avec le processus technologique;
• des exigences élevées pour le professionnalisme des assistants de laboratoire.

Conseils! Il est préférable d'effectuer une telle analyse uniquement dans les laboratoires les meilleurs et les plus professionnels, où des systèmes de contrôle de qualité stricts ont été mis en place.

Pour la fiabilité des résultats, il est nécessaire de suivre les règles de préparation préalable à l'analyse:

• lorsque vous donnez de la salive, vous ne devez pas manger ni boire de médicaments quatre heures avant l'analyse, avant la procédure, rincez-vous la bouche avec de l'eau bouillie, puis effectuez un petit massage de la peau afin de sécréter un secret de la glande;
• l'urine est généralement collectée à domicile. Avant cela, il est nécessaire de laver les organes génitaux et de collecter 50 ml de la première urine du matin dans un récipient spécial, il est déconseillé de collecter le matériel pendant la menstruation;
• avant de donner du sperme, un homme ne doit pas avoir de relations sexuelles pendant trois jours, ne pas aller au sauna, ne pas nager dans un bain chaud, ne pas prendre de boissons alcoolisées et de nourriture épicée. Immédiatement avant l'analyse, il est interdit d'uriner pendant trois heures ;
• pour la réalisation d'un frottis urogénital, l'absence de rapport sexuel pendant trois jours est recommandée. Les médicaments antibactériens sont interdits deux semaines avant l'analyse. Pendant une semaine, vous devez arrêter d'utiliser des gels intimes, des pommades, des suppositoires vaginaux et ne pas vous doucher. Trois heures avant de prendre le biomatériau, il faut s'abstenir d'aller aux toilettes.
• le sang est donné le matin à jeun.

Le matériel de diagnostic doit être collecté dans des conditions qui excluent sa contamination, car cela peut affecter de manière significative la véracité du résultat de la PCR.

Décryptage de l'analyse

L'analyse peut montrer un résultat positif ou négatif. Négatif signifie qu'il n'y a pas d'infection suspectée dans le corps et que la personne est en bonne santé. Positif dit que le patient est malade et a besoin d'un traitement. Tous les indicateurs doivent être déchiffrés et exprimés par le médecin. Vous ne devriez pas être contrarié et avoir peur des mauvais résultats, la thérapie est prescrite sur la base de ceux-ci, l'essentiel est de ne pas retarder le processus et de ne pas s'auto-médicamenter.

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Je suis médecin généraliste et médecin généraliste. Ma compétence comprend les questions de diagnostic précoce des patients et de traitement de nombreuses maladies du tractus gastro-intestinal, des poumons et des voies respiratoires, du foie, des reins, des systèmes cardiovasculaire et génito-urinaire, des maladies de la peau, des troubles métaboliques, etc. 15 ans d'expérience en tant que médecin généraliste dans polycliniques de Moscou, dont 5 travaillaient dans un hôpital de Saint-Pétersbourg .. Je serai heureux de répondre aux questions des lecteurs de mon blog.

Dans la médecine moderne, une plus grande importance est accordée aux méthodes de recherche en laboratoire de haute précision basées sur la réaction en chaîne de la polymérase. Grâce à l'utilisation des technologies PCR, il est devenu possible d'analyser au niveau génétique moléculaire et d'identifier les formes aiguës et chroniques de maladies héréditaires et infectieuses chez un patient bien avant l'apparition des symptômes cliniques.

Qu'est-ce que la PCR - diagnostic

Cette méthode a été développée par la biochimiste américaine et lauréate du prix Nobel Carrie Mullis en 1984.

De nombreux spécialistes qualifiés sont confrontés quotidiennement à une étude PCR et ne peuvent, sans ses résultats, diagnostiquer avec précision la plupart des formes actives de pathologies dans les cas où les méthodes immunologiques et microbiologiques ne fonctionnent pas. Il arrive souvent que des virus différents provoquent les mêmes symptômes cliniques, L'analyse PCR vous permettra de déterminer l'agent pathogène à sa plus faible concentration dans le biomatériau et d'identifier même des cellules individuelles de virus ou de bacilles.

À propos du diagnostic PCR en vidéo

La base du diagnostic PCR est la dans des conditions de laboratoire spéciales d'amplification répétée (multiplication) de certaines sections d'ADN (acide désoxyribonucléique) - le matériel génétique humain.

L'ensemble du processus technologique de copie comprend plusieurs étapes:

1. Dénaturation – préparation de l'échantillon, en augmentant la température du biomatériau (jusqu'à 95 °C), l'ADN 2 brins est scindé en deux brins distincts.
2. Recuit - le biomatériau étudié est refroidi et des amorces azotées (réactifs) y sont ajoutées, qui ont la capacité de reconnaître spécifiquement dans la molécule d'ADN des séquences caractéristiques uniquement d'un agent pathogène et de se combiner avec elles.
3. allongements - la réaction de polymérase elle-même, un site génétique moléculaire unique est complété, dans chacune des connexions avec l'amorce, une nouvelle chaîne d'ADN fille, complémentaire de la structure, est formée.

L'ensemble du cycle est répété 20 à 30 fois. En fin de compte, le nombre de brins d'ADN complémentaires est formé, ce qui est suffisant pour l'analyse visuelle et la comparaison des résultats avec les données disponibles sur la structure cellulaire de divers agents pathogènes. Le virus est déterminé, la nature de son apparition, la force de son effet sur le corps et le nombre de bacilles disponibles sont établis. Ces informations sont d'une grande valeur pour le médecin traitant lors de la prescription de méthodes thérapeutiques efficaces et de la sélection de médicaments.

Les méthodes de diagnostic par PCR diffèrent des autres méthodes de laboratoire sur les points suivants :

• détermination directe de la présence d'agents pathogènes;
• haute sensibilité, spécificité et polyvalence de la procédure de détection du virus ;
• rapidité d'analyse;
• la capacité de diagnostiquer des pathologies asymptomatiques.

Les résultats de l'étude peuvent être photographiés ou insérés dans des supports d'information pour la possibilité de leur évaluation par des experts indépendants.

Comment se préparer au test PCR ?

Divers biomatériaux sont utilisés pour la recherche :

• du sang;
• vase;
• salive
• urine;
• expectorations;
• grattages de l'épithélium;
• jus de prostate;
• écorchures des muqueuses;
• liquide amniotique;
• tissu placentaire;
• liquide céphalo-rachidien, articulaire ou pleural ;
• sécrétion des organes génitaux.

Un équipement de laboratoire moderne et le professionnalisme du laborantin garantissent au patient qui subit une analyse PCR d'obtenir un résultat fiable. Mais la précision de l'étude dépend de la préparation correcte du test et du respect de toutes les recommandations pour la sélection du biomatériau.

Il n'est pas difficile de bien se préparer à l'analyse, il est important de suivre toutes les règles existantes :

1. La veille de l'étude, n'ayez pas de rapports sexuels.
2. Annulez le gymnase.
3. Ne vous rendez pas dans un bain ou un sauna avant l'examen.
4. Vous devez dîner la veille au plus tard 20 heures, ne pas vous mêler d'aliments épicés et gras, ne pas prendre d'alcool.
5. Le sang veineux doit être prélevé le matin, ne pas manger, boire ou fumer avant l'intervention.

Comment les femmes et les hommes passent les tests PCR - caractéristiques de la procédure

La principale exigence générale pour la sélection du biomatériau est d'obtenir la concentration maximale de micro-organismes dans l'échantillon et l'absence d'impuretés indésirables - mucus, sang ou pus.

Lors de l'examen d'infections transmises par contact sexuel (uréeplasmose, gardnerellose, chlamydia, mycoplasmose, trichomonase), les sécrétions des organes génitaux sont prélevées:

• chez les hommes, un écouvillon ou un grattage est prélevé dans le canal urinaire (urètre);
• chez les femmes - un frottis ou un grattage du vagin, du canal cervical.

Lors du prélèvement de matériel du tractus urogénital, il est important d'éviter la pénétration d'impuretés. À cette fin, des grattages sont prélevés sur les hommes au plus tôt 2 heures après la dernière miction, sur les femmes - en tenant compte des jours du cycle menstruel. L'excès de mucus ou de pus est éliminé avec des cotons-tiges stériles, le biomatériau est prélevé à l'aide de sondes en plastique spéciales - cela réduit la probabilité que du sang pénètre dans l'échantillon.

La procédure de prélèvement d'un grattage urogénital est assez douloureuse pour les hommes. , c'est pourquoi la première portion d'urine après un retard nocturne, qui contient la plus grande quantité d'épithélium, est souvent utilisée pour l'analyse. L'urine est recueillie dans un récipient stérile avec un couvercle hermétique et livrée au laboratoire au plus tard deux heures après le prélèvement. Au laboratoire, pour des travaux ultérieurs, un sédiment urinaire cellulaire est obtenu par centrifugation.

Quelles infections sont incluses dans le complexe PCR-12 ?

Le diagnostic PCR est activement utilisé par des spécialistes expérimentés. Le plus populaire est le diagnostic des virus et des infections.

Actuellement, les techniques de réaction en chaîne par polymérase élargissent les possibilités de mener des recherches - l'introduction du génotypage et l'épissage de fragments d'ADN de tissus sont largement utilisés dans différents domaines de la médecine moderne :

• gynécologie;
• urologie;
• pneumologie;
• gastro-entérologie;
• hématologie;
• oncologie.

Où puis-je obtenir des tests bon marché à l'URFO ?

Les méthodes modernes de diagnostic PCR sont en constante évolution. La technique elle-même est en cours d'amélioration, de nouveaux types de PCR et de nouveaux systèmes de test utilisés pour la réaction en chaîne font leur apparition. Grâce à ces innovations, le coût de ces tests devient plus abordable pour les patients.

Le frottis PCR dans le diagnostic des maladies infectieuses présente les avantages suivants :

• Détection directe des agents pathogènes des maladies infectieuses.

De nombreuses méthodes traditionnelles de diagnostic en laboratoire impliquent l'identification d'agents pathogènes par divers signes indirects. Par exemple, le diagnostic ELISA est basé sur la détection dans le sang du patient de protéines qui sont des produits de désintégration d'agents pathogènes infectieux, sur la base desquels le médecin peut établir un diagnostic particulier. La méthode d'analyse PCR donne une indication directe de la présence dans le matériel prélevé sur le patient d'une région spécifique de l'ADN de l'agent causal de la maladie.

• Haute spécificité des diagnostics PCR.

Au cours de l'analyse, un fragment d'ADN spécifique est isolé dans le matériel de test, c'est-à-dire inhérent uniquement à un agent pathogène spécifique - uniquement une certaine bactérie ou virus. Cette section d'ADN est unique et n'est caractéristique d'aucune infection sur terre.

• PCR haute sensibilité.

La détection de l'infection est possible même si le matériel prélevé sur le patient ne contient qu'une seule cellule d'une bactérie ou d'un virus. Par rapport à d'autres méthodes de diagnostic immunologique et microbiologique: la sensibilité de l'analyse PCR est de 10 à 100 cellules par échantillon, d'autres méthodes - de 103 à 105 cellules.

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• Polyvalence de l'analyse PCR.

Pour la recherche par PCR, presque tous les matériaux peuvent être utilisés, y compris ceux qui ne sont pas disponibles pour la recherche par d'autres méthodes : mucus, urine, sang, sérum, crachats, éjaculat, grattage des cellules épithéliales - puisque l'infection peut être contenue dans n'importe quelle sécrétion biologique et tissus.

• Grande vitesse d'obtention du résultat de l'analyse PCR.

Une seule méthode de traitement du matériel prélevé pour analyse chez un patient, la détection des produits de réaction, l'amplification PCR automatisée permettent de réaliser un diagnostic PCR complet en 4-5 heures. Dans le même temps, beaucoup plus de temps est consacré aux méthodes de recherche culturelle - de plusieurs jours à plusieurs semaines, car il est nécessaire d'isoler puis de développer l'agent pathogène en culture cellulaire.

• La capacité de diagnostiquer tout type d'infection.

La haute sensibilité de la méthode PCR permet de diagnostiquer une infection non seulement au stade aigu de la maladie, mais également des infections chroniques et même la présence de bactéries ou de virus isolés.

Un frottis par PCR permet d'identifier des infections non détectables dans un frottis de flore : chlamydia, ureaplasmose, mycoplasmose, herpès génital.

Quelle que soit l'importance de la méthode de recherche, le diagnostic par PCR présente également certaines limites. Les inconvénients des diagnostics PCR comprennent :

• Possibilité d'obtenir un résultat faussement positif

L'analyse PCR peut montrer un résultat positif même si l'infection est déjà morte, "tuée" par les antibiotiques, mais ses cellules mortes sont toujours contenues dans les tissus du patient. Comment est-ce possible? Très simple. Par exemple, l'infection vit dans les cellules épithéliales (sur la membrane muqueuse des organes génitaux ou des yeux). Et elle a été guérie. Mais il faut du temps pour « renouveler » les cellules épithéliales. Si le matériel est pris par un médecin avant la période de renouvellement cellulaire complet, le matériel peut contenir des cellules mortes de l'infection. Les cellules contiennent évidemment du matériel génétique - l'ADN ou l'ARN de l'agent pathogène, qui "recherche" la PCR. La PCR ne distingue pas les cellules mortes des vivantes : elle recherche l'ADN, et les "clone" en grande quantité. Le résultat de cette analyse est positif. En fait, c'est un faux positif.

L'incapacité de la PCR à "distinguer" une infection morte d'une infection vivante impose certaines exigences lors de l'utilisation de la PCR et pour le suivi de l'efficacité du traitement. La règle principale, bien sûr, est d'attendre que les restes morts de l'infection soient complètement éliminés du corps, ce qui, chez la personne moyenne, se produit dans les 4 à 8 semaines. Passé ce délai, après la prise du dernier comprimé antibiotique, la méthode PCR peut et doit être utilisée pour contrôler l'efficacité du traitement.

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Aux périodes antérieures, le contrôle de la guérison ne peut s'effectuer qu'à l'aide de la méthode culturale, ou inoculation : seuls les micro-organismes viables se multipliant peuvent servir de signe d'incurabilité.

• Il n'est pas souhaitable d'utiliser l'analyse PCR pour le diagnostic de la gardnerellose, car la gardnerella, les agents responsables de cette maladie, vit normalement dans le vagin en petite quantité. L'ADN de ces bactéries, lors de l'utilisation de la PCR, sera retrouvé encore et encore. Gardnerella ne doit pas être dans le frottis, et la bactérioscopie dans ce cas est une méthode suffisante pour diagnostiquer la gardnerellose et surveiller le traitement.
• Variabilité des micro-organismes

Tout microbe a la capacité de changer, et au niveau de l'ADN. L'exemple le plus frappant dans ce domaine est le virus de la grippe. Après avoir été malade une fois, une personne développe des anticorps contre le virus. Purement théoriquement, si nous avons eu la grippe au moins une fois, alors, comme la varicelle, nous ne devrions pas tomber malades une deuxième fois. Mais nous tombons malades presque chaque année. Quelle est la raison? Le virus « mute », « modifie » légèrement son génome, et notre système immunitaire, nos anticorps ne « reconnaissent » plus l'ancien invité sous une nouvelle forme. Malheureusement, vous devez à nouveau attraper la grippe ...

Lors de la conception d'un amplificateur (système de test PCR), un fragment d'ADN spécifique à un micro-organisme donné est utilisé, qui est le moins susceptible de changer. Il est "sélectionné" dans la région dite hautement conservée de l'ADN. Mais la variabilité des micro-organismes peut conduire au fait que certains génotypes ou souches de l'agent pathogène à l'étude peuvent acquérir des mutations dans la région amplifiée (clonée) du génome, et ainsi devenir insaisissables par ce système de test.

Ainsi, différents systèmes de test sont l'une des raisons pour lesquelles les analyses effectuées dans différents laboratoires et dans différentes cliniques par la «même» méthode PCR peuvent montrer des résultats diamétralement opposés. Afin d'éviter autant que possible les erreurs de mutation, des normes ont maintenant été développées qui régissent la portée des tests (y compris les tests de réactions croisées, ainsi que les tests de souches connues d'un agent pathogène détectable) qu'un système de test doit passer avant qu'il entre sur le marché et est utilisé pour diagnostiquer votre santé. C'est pourquoi les bonnes cliniques et laboratoires utilisent la dernière génération de kits de test. Et notre centre médical "Euromedprestige" est l'un des rares à pouvoir offrir à ses clients des diagnostics de haute qualité.

La réaction en chaîne par polymérase (en abrégé PCR) est une méthode de diagnostic moderne et ultra-précise au niveau génétique et moléculaire. Le diagnostic PCR permet de déterminer si une personne a une infection ou une maladie héréditaire.

L'essence de la méthode réside dans le fait que l'ADN ou l'ARN du matériel prélevé pour l'étude est soumis à une multiplication multiple (amplification), ce qui est possible en présence d'enzymes. De ce fait, une grande masse d'ADN ou d'ARN est obtenue, selon laquelle une évaluation visuelle est effectuée. Les spécialistes disposent d'une base de données d'informations sur la structure de tous les agents pathogènes et, conformément à celle-ci, une évaluation est faite du micro-organisme obtenu.

Le matériel de test (salive, sang, crachats, etc.) est placé à l'intérieur d'un appareil spécial (amplificateur) et certaines enzymes sont ajoutées. Ils se combinent avec l'ADN ou l'ARN étudié et provoquent la synthèse de leurs copies. Grâce à la PCR, il est possible de déterminer le type d'agent pathogène, sa quantité.

Intéressant! La méthode PCR a été inventée en 1983 par la scientifique américaine Carrie Mullis. Pour cette découverte, il a reçu le prix Nobel de chimie.

Tubes à essai avec matériel d'essai

Avantages et inconvénients

La technique PCR a été utilisée récemment dans le domaine de la médecine et a pris une place importante dans le processus de diagnostic.

Avantages de la méthode :

1. Identification directe de l'agent pathogène. Certaines méthodes, par exemple le dosage immunoenzymatique, permettent d'identifier les protéines sécrétées par les microbes. Il s'agit d'une définition indirecte de la présence d'agents pathogènes. Et au moyen de la PCR, un morceau d'ADN appartenant à une certaine infection est détecté avec une grande précision.
2. La spécificité de la technique. Étant donné que la PCR détecte l'ADN appartenant à l'agent pathogène, il est presque impossible d'obtenir une fausse conclusion (à l'exception d'un agent pathogène inconnu). Et avec la méthode immunologique, une erreur peut survenir en raison d'une réaction croisée entre les antigènes.
3. Grande sensibilité. La méthode détecte la présence même d'une très petite quantité de bactéries ou de virus dans le corps. 10 cellules pathogènes par échantillon sont suffisantes. Pour les autres méthodes, le nombre minimum de cellules doit être d'au moins 105.
4. La polyvalence de la technique. Le processus de recherche pour différents micro-organismes est similaire en raison de la similitude de tous les ADN, ARN. Sur cette base, il est possible d'identifier plusieurs agents pathogènes dans un échantillon.
5. Conclusion rapide. Du moment de l'échantillonnage à l'obtention du résultat, il ne s'écoule pas plus de 4 à 5 heures. Avec la PCR, aucune culture n'est nécessaire, la méthode est donc assez rapide.
6. L'efficacité du diagnostic dans les types d'infections latentes. La méthode révèle les micro-organismes difficiles ou pas du tout cultivables. Ces agents pathogènes se trouvent dans les formes latentes de la maladie.
7. Large champ d'utilisation. La PCR peut être utilisée non seulement pour diagnostiquer des maladies humaines, mais aussi pour déterminer les micro-organismes dans le sol, les aliments, l'eau, etc.

Mais vous pouvez aussi faire face aux inconvénients de la méthode PCR :

1. Les microbes peuvent changer. Les agents pathogènes peuvent changer et muter. Par conséquent, ils peuvent ne pas être détectables par PCR.
2. La possibilité de multiplier l'ADN non seulement d'un pathogène vivant, mais aussi mort. Pour éviter une telle situation, la PCR ne peut être utilisée que 1 à 2 mois après la guérison d'une maladie antérieure.

Variétés de PCR

La méthode de recherche est utilisée à diverses fins, de sorte que la technique PCR a des variétés:

1. Avec transcription inverse - utilisé pour le doublement répété et la détermination ultérieure de quel ARN de quel micro-organisme a été isolé. Pour ce faire, utilisez une bibliothèque de données sur les structures de divers agents pathogènes.
2. Inversé - utilisé lorsqu'il y a une petite zone dans une séquence particulière.
3. Niché - utilisé pour réduire la quantité de produits de réaction indésirables. A ces fins, deux études consécutives sont réalisées.
4. Asymétrique - utilisé si vous avez besoin de multiplier davantage l'une de toutes les chaînes d'ADN disponibles.
5. Quantitatif (en temps réel) - nécessaire pour une étude directe de la façon dont la quantité du produit obtenu change à chaque nouveau cycle de la réaction PCR.
6. Numérique - le plus moderne et le plus précis.
7. Spécifique au groupe - il s'agit d'une étude réalisée dans le but d'étudier les liens familiaux.
8. Pas à pas - réduit l'influence de l'interaction non spécifique des amorces.

Remplir des tubes avec des échantillons de sang

Déchiffrer les résultats

Dans la conclusion de l'étude, une réponse sans ambiguïté est donnée sur la présence d'un agent pathogène, ce qui se produit :

• négatif, cela signifie qu'il n'y a pas d'infection ;
• positif - il est.

L'identification de l'infection peut se produire même en l'absence de symptômes de la maladie chez une personne. C'est le stade initial de l'infection. Parfois, vous pouvez obtenir une réponse faussement positive (à la limite d'un résultat négatif et d'un résultat positif). Dans ce cas, l'analyse doit être répétée. Une attention particulière doit être accordée pour s'assurer que le matériel a été collecté en pleine conformité avec toutes les exigences.

Délais pour l'analyse PCR

En pratique, le résultat de l'étude peut être obtenu en 2 jours. Parfois, cela peut être fait plus rapidement - le jour de la livraison.

Prix ​​de la procédure

Le coût de la PCR est déterminé par l'infection qui sera testée. Cela dépend aussi de la méthodologie de test. Le prix moyen de l'analyse est compris entre 200 et 850 roubles. Le prix comprend également des frais pour la collecte du matériel - environ 400 roubles.

Prix ​​approximatifs pour les tests PCR.

Souvent, les établissements médicaux proposent d'analyser plusieurs infections en même temps afin d'identifier la bonne. Un tel examen coûtera plus cher, mais il éliminera le besoin d'études supplémentaires, ce qui fera gagner du temps au patient.

Vidéo "Réaction en chaîne de la polymérase"

La vidéo raconte l'essence de la méthode PCR et ses avantages. Filmé par la chaîne SiberianMedicalLaboratory.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

L'essence de la méthode PCR. ADN polymérase

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode expérimentale de biologie moléculaire qui permet d'obtenir une augmentation significative de petites concentrations de certains fragments d'acide nucléique dans un matériel biologique. Ce processus d'augmentation du nombre de copies d'ADN est appelé amplification. La copie d'ADN pendant la PCR est réalisée par une enzyme spéciale - polymérase. L'ADN polymérase (Fig. 3) est une enzyme impliquée dans la réplication (amplification de l'ADN dans les organismes vivants) de l'ADN. Les enzymes de cette classe catalysent la polymérisation des désoxyribonucléotides le long de la chaîne nucléotidique de l'ADN, que l'enzyme "lit" et utilise comme matrice. Le type d'un nouveau nucléotide est déterminé par le principe de complémentarité avec la matrice à partir de laquelle la lecture est effectuée.

L'ADN polymérase ajoute des nucléotides libres à l'extrémité 3" de la chaîne assemblée. Cela conduit à un allongement de la chaîne dans le sens 5"-3. Aucune des ADN polymérases connues n'est capable de créer une chaîne "à partir de zéro": elles sont seulement capable d'ajouter des nucléotides au groupe 3"-hydroxyle déjà existant. Pour cette raison, l'ADN polymérase a besoin apprêt- une courte séquence de nucléotides (généralement 20-25), complémentaire des sections terminales du gène étudié - à laquelle elle pourrait ajouter le premier nucléotide. Les amorces sont toujours composées de bases d'ADN et d'ARN, les deux premières bases étant toujours des bases d'ARN. Les amorces sont synthétisées par une autre enzyme - primase. Une autre enzyme est hélicase- nécessaire au déroulement de la double hélice d'ADN avec la formation d'une structure simple brin, qui assure la réplication des deux brins conformément au modèle semi-conservateur de réplication de l'ADN.

Certaines ADN polymérases ont également la capacité de corriger les erreurs dans le brin d'ADN nouvellement assemblé. Si une paire incorrecte de nucléotides est détectée, l'ADN polymérase revient en arrière d'une étape, supprime le mauvais nucléotide de la chaîne, puis insère le bon à sa place, après quoi la réplication se poursuit comme d'habitude.

Réalisation de PCR

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode d'amplification de l'ADN qui peut isoler et multiplier une certaine séquence d'ADN des milliards de fois en quelques heures. La possibilité d'obtenir un grand nombre de copies d'une région strictement définie du génome simplifie grandement l'étude d'un échantillon d'ADN existant.

Pour que la réaction en chaîne par polymérase ait lieu, un certain nombre de conditions doivent être remplies. Pour la PCR, dans le cas le plus simple, les composants suivants sont requis :

Une matrice d'ADN contenant la section d'ADN à amplifier.

Deux amorces complémentaires aux extrémités du fragment recherché. (Une paire d'oligonucléotides synthétisés artificiellement, généralement de 15 à 30 pb, identiques aux régions correspondantes de l'ADN cible. Ils jouent un rôle clé dans la formation des produits de réaction d'amplification. Des amorces correctement sélectionnées garantissent la spécificité et la sensibilité du test système.)

ADN polymérase thermostable. La polymérase utilisée dans la PCR doit rester active à haute température pendant longtemps, c'est pourquoi des enzymes isolées de thermophiles - Thermus aquaticus (Taq polymérase) et autres sont utilisées.

Désoxynucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ions Mg 2+ nécessaires au fonctionnement de la polymérase.

Une solution tampon qui fournit les conditions de réaction nécessaires - pH, force ionique de la solution. Contient des sels, de l'albumine sérique.

Pour éviter l'évaporation du mélange réactionnel, une huile à point d'ébullition élevé, telle que la vaseline, est ajoutée au tube à essai. Si un appareil avec un couvercle chauffant est utilisé, cela n'est pas nécessaire.

L'ajout de pyrophosphatase peut augmenter le rendement de la réaction PCR. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse du pyrophosphate, un sous-produit de l'addition de nucléotides triphosphates au brin d'ADN en croissance, en orthophosphate. Le pyrophosphate peut inhiber la réaction PCR.

Pour multiplier le nombre de copies de l'ADN d'origine, une réaction cyclique est nécessaire. En règle générale, chacun des cycles de PCR répétés séquentiellement se compose de trois étapes :

1. Dénaturation ou "fusion" de l'ADN. La matrice d'ADN double brin est chauffée à 94 - 96°C (ou 98°C si une polymérase particulièrement thermostable est utilisée) pendant 0,5 - 2 minutes pour permettre aux brins d'ADN de se séparer. Cette étape est appelée dénaturation car les liaisons hydrogène entre les deux brins d'ADN sont rompues. Parfois, avant le premier cycle (avant d'ajouter la polymérase), le mélange réactionnel est préchauffé pendant 2 à 5 minutes pour dénaturer complètement la matrice et les amorces. Cette approche est appelée démarrage à chaud, il permet de réduire la quantité de produits de réaction non spécifiques.

2. Recuit - liaison des amorces à l'ADN matrice. Une fois les brins séparés, la température est lentement abaissée pour permettre aux amorces de se lier à la matrice simple brin. La température de recuit dépend de la composition de l'apprêt et est généralement choisie entre 50 et 65 °C. Temps de scène - 20 - 60 secondes. Un choix incorrect de la température de recuit conduit soit à une mauvaise liaison des amorces à la matrice (à température élevée), soit à une liaison au mauvais endroit et à l'apparition de produits non spécifiques (à basse température).

3. La synthèse (allongement de la chaîne). L'ADN polymérase réplique le brin matrice en utilisant l'amorce comme "graine". La polymérase démarre la synthèse du deuxième brin à partir de l'extrémité 3" de l'amorce, qui s'est liée à la matrice et se déplace le long de la matrice. La température d'élongation dépend de la polymérase. Les polymérases Taq et Pfu couramment utilisées sont les plus actives à 72 ° C. la longueur du fragment à amplifier En règle générale, le temps d'élongation est pris à une minute pour mille paires de bases Une fois tous les cycles terminés, une étape supplémentaire est souvent effectuée allongement final pour compléter tous les fragments simple brin. Cette étape dure 7 à 10 minutes.

Par la suite, les étapes de dénaturation, de recuit et d'élongation sont répétées plusieurs fois (30 fois ou plus). A chaque cycle, le nombre de copies synthétisées d'un fragment d'ADN double.

Toutes les réactions sont effectuées dans des tubes à essai immergés dans un thermostat. La modification du régime de température et son entretien sont effectués automatiquement.

Pour comprendre exactement comment l'amplification d'un certain segment d'ADN se produit pendant la PCR, il est nécessaire de comprendre clairement la position de toutes les amorces et leurs séquences complémentaires dans les chaînes amplifiables à chaque tour. Au premier tour, chacune des chaînes nouvellement synthétisées est beaucoup plus longue que la distance entre le groupe 3"-hydroxyle de son amorce et le nucléotide terminal de la séquence complémentaire de la deuxième amorce. De telles chaînes sont appelées "modèles longs", il c'est sur eux que s'effectuera la synthèse.

Dans le deuxième tour, l'ADN double brin, constitué de brins similaires et nouvellement synthétisés (matrice longue), est à nouveau dénaturé puis recuit avec des amorces. Au cours de la synthèse dans ce cycle, des "modèles longs" sont à nouveau synthétisés, ainsi qu'un certain nombre de brins avec une amorce à une extrémité et avec une séquence complémentaire de la seconde amorce à l'autre ("modèles courts"). Au cours du troisième tour, tous les hétéroduplex formés précédemment sont simultanément dénaturés et recuits avec des amorces, puis répliqués. Dans les tours suivants, il y a de plus en plus de "matrices courtes", et au 30ème tour, leur nombre est déjà 10 6 fois supérieur au nombre de chaînes initiales ou "matrices longues".

La quantité de produit de réaction spécifique (limitée par les amorces) augmente théoriquement proportionnellement à 2 n , où n est le nombre de cycles de réaction. En fait, l'efficacité de chaque cycle peut être inférieure à 100 %, donc en réalité :

où P est la quantité de produit, E est le rendement moyen du cycle.

Le nombre de copies d'ADN "longues" augmente également, mais de manière linéaire, de sorte qu'un fragment spécifique domine dans les produits de réaction. La croissance du produit requis est exponentiellement limitée par la quantité de réactifs, la présence d'inhibiteurs et la formation de sous-produits.

La PCR est une méthode très sensible, par conséquent, s'il y a même une quantité insignifiante d'ADN dans l'échantillon de test qui passe accidentellement d'un mélange réactionnel à un autre, des résultats faussement positifs peuvent être obtenus. Il est donc nécessaire de contrôler soigneusement toutes les solutions et tous les ustensiles utilisés pour la PCR.

Principes de base de la sélection des amorces.

Lors de la création d'un système de test PCR, l'une des tâches principales est la sélection correcte des amorces qui doivent répondre à un certain nombre de critères :

1. Les amorces doivent être spécifiques. Une attention particulière est portée aux extrémités 3 "des amorces, car c'est à partir d'elles que la Taq polymérase commence à compléter la chaîne d'ADN complémentaire. Si leur spécificité est insuffisante, des processus indésirables se produiront très probablement dans le tube à essai avec le mélange réactionnel , à savoir la synthèse d'ADN non spécifique (fragments courts ou longs). Il est visible en électrophorèse sous forme de bandes supplémentaires lourdes ou légères. Cela rend difficile l'évaluation des résultats de la réaction, car il est facile de confondre un produit d'amplification avec de l'ADN étranger synthétisé. Certaines amorces et dNTP sont consommés pour la synthèse d'ADN non spécifique, ce qui entraîne une perte de sensation importante.

2. Les amorces ne doivent pas former de dimères et de boucles, c'est-à-dire aucun double brin stable ne doit être formé en annelant les amorces à elles-mêmes ou les unes aux autres.