PCR materjal. polümeraasi ahelreaktsioon

Kaasaegsed kõrgtehnoloogilised laboriuuringute meetodid võimaldavad haigusi varajases staadiumis tuvastada. Nakkushaigused arenevad ja arenevad, neid tuleb aina juurde ning neid on üha raskem tuvastada. PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) diagnoosimine on üks uusimaid ja täpsemaid. Selle arendamise eest pälvis teadlane Kary Mullis Nobeli preemia.

polümeraasi ahelreaktsioon- molekulaargeneetilise diagnostika meetod, mis võimaldab leida inimestel erinevat tüüpi nakkuslikke ja pärilikke patoloogiaid nii ägedas kui kroonilises vormis ning ammu enne, kui patoloogia hakkab avalduma. Enamik arste seisab selle analüüsiga iga päev silmitsi ega kujuta enam ette, kuidas ilma selleta on võimalik õiget diagnoosi ja haiguse staadiumi teha.

PCR-i diagnostika olemus

PCR analüüsis kasutatakse molekulaarbioloogia põhimõtteid. Selle rakendamisel kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis kopeerivad korduvalt RNA ja DNA fragmente, samuti haigusi põhjustavaid mikroorganisme, mida leidub inimese bioloogilistes materjalides. Kopeerimine toimub mitmes etapis, seega moodustub ahelreaktsioon. Seejärel kontrollivad laborispetsialistid saadud andmeid ühise andmebaasiga ning tuvastavad haiguse tekitajad, samuti nende kontsentratsiooni. Diagnostika viiakse läbi spetsiaalses seadmes, mis jahutab ja soojendab katseklaasi biomaterjaliga ja mida nimetatakse võimendiks. Temperatuurirežiimi järgimine mõjutab analüüsitulemuste õigsust.

Mikroorganismide DNA fragmendid võivad sisalduda järgmistes bioloogilistes materjalides:

• bioloogilised vedelikud;
• veri ja selle derivaadid;
• epiteelirakkude kraapimine või määrimine;
• uriin;
• röga;
• lima ja muud bioloogilised eritised;
• Seedetrakti limaskesta biopaadid.

Kus kasutatakse PCR diagnostikat?

Nakkushaiguste diagnoosimise võimalused polümeraasi ahelreaktsiooni abil on suured, selle abil saab tuvastada väga erinevaid infektsioone põhjustavaid viirusi, näiteks:

See ei ole täielik loetelu haigustest, mis tuvastatakse PCR-analüüsi abil. Enamik neist patoloogiatest on varajases staadiumis peaaegu nähtamatud, kuid nende mõju kehale on äärmiselt negatiivne ja sageli ohtlik inimeste tervisele ja elule.

Rasedatele määratakse sugulisel teel levivate infektsioonide tuvastamiseks PCR-analüüs, mis suurendab oluliselt emakakaelavähi riski, mõjutades negatiivselt raseduse kulgu ja lapse tervist. Seetõttu on suguhaiguste diagnoosimine äärmiselt oluline, et vältida loote nakatumist patogeensete mikroorganismidega.

Kõigest eelnevast lähtudes võime järeldada, et PCR-meetodit kasutav laboratoorne diagnostika aitab arstil määrata täpse diagnoosi ja määrata igal üksikjuhul efektiivse ravi.

See on huvitav! Lisaks meditsiinile kasutatakse PCR meetodit ka muudes valdkondades, näiteks kohtuekspertiisis, kui on vaja tuvastada, kellele kuulub kuriteopaigalt leitud biomaterjal ning mõnikord kasutatakse PCR-i ka isaduse määramiseks, katsete läbiviimiseks. DNA mutatsioon ja muud katsed.

Meetodi plussid ja miinused

PCR-diagnostika eelised on järgmised:

• testi kõrge tundlikkus võimaldab määrata isegi üksikuid patogeeni tekitajaid, mis võimaldab tuvastada patoloogiat varajases staadiumis, kroonilise ja varjatud vormiga;
• meetodi mitmekülgsus võimaldab uurimistööks kasutada peaaegu kõiki biomaterjale süljest naharakkudeni;
• suur katvus - ühe proovi uurimisel on võimalik määrata mitme erineva patogeeni olemasolu;
• täpsus - selle uuringumeetodi kõrge tase võimaldab teil mitte anda valenäitajaid;
• kiirus - tulemus on valmis keskmiselt viie tunniga, see tähendab, et patsient saab järeldusele järele tulla juba järgmisel päeval pärast biomaterjali kohaletoimetamist;
• suhteliselt madal hind - see diagnostiline meetod ei erine teistest laboratoorsetest vereanalüüsidest;
• seda meetodit kasutades on võimalik teha prekliinilist ja retrospektiivset diagnostikat. Esimene tuvastab patogeensed mikroorganismid juba enne haiguse avaldumist ja teine ​​viiakse läbi pärast patoloogia ülekandmist, mis võimaldab vältida patoloogia väljakujunemist ja õigeaegselt ravida, samuti määrata haiguse arengut. haiguse varjatud vorm, mis esineb ilma ilmsete sümptomiteta.

Kuid täiuslikke diagnostilisi meetodeid pole olemas, seetõttu on PCR-il puudused:

• kõrged nõuded tehnoloogilise protsessi järgimisele;
• kõrged nõuded laborantide professionaalsusele.

Nõuanne! Parem on selline analüüs läbi viia ainult parimates ja professionaalsemates laborites, kus on kehtestatud ranged kvaliteedikontrollisüsteemid.

Tulemuste usaldusväärsuse tagamiseks on vaja järgida analüüsiks ettevalmistamise reegleid:

• sülje andmisel ei tohi neli tundi enne analüüsi süüa ja juua ravimeid, enne protseduuri loputage suud keedetud veega, seejärel tehke väike nahamassaaž, et sekreteerida näärmest saladus;
• uriin kogutakse tavaliselt kodus. Enne seda on vaja pesta genitaale ja koguda 50 ml esimest hommikust uriini spetsiaalsesse anumasse, menstruatsiooni ajal ei ole soovitav materjali koguda;
• Enne sperma loovutamist ei tohi mees kolm päeva seksida, saunas käia, kuumas vannis ujuda, alkohoolseid jooke ja vürtsikat toitu võtta. Vahetult enne analüüsi on kolm tundi keelatud urineerida;
• urogenitaalse äigepreparaadi kohaletoimetamiseks on soovitatav kolm päeva seksuaalvahekorrast puududa. Kaks nädalat enne analüüsi on antibakteriaalsed ravimid keelatud. Nädalaks peate lõpetama intiimsete geelide, salvide, vaginaalsete ravimküünalde kasutamise ja ärge dušige. Kolm tundi enne biomaterjali võtmist on vaja hoiduda tualetti minekust.
• verd antakse hommikul tühja kõhuga.

Diagnostika materjali tuleks koguda tingimustel, mis välistavad selle saastumise, kuna see võib oluliselt mõjutada PCR-i tulemuse õigsust.

Analüüsi dešifreerimine

Analüüs võib näidata positiivset või negatiivset tulemust. Negatiivne tähendab, et organismis pole nakkuskahtlust ja inimene on terve. Positiivne ütleb, et patsient on haige ja vajab ravi. Arst peab kõik näitajad dešifreerima ja väljendama. Te ei tohiks olla ärritunud ja karta halbu tulemusi, nende põhjal määratakse ravi, peamine on mitte protsessi edasi lükata ja mitte ise ravida.

Kas teile meeldis meie artikkel? Jaga sõpradega sotsiaalvõrgustikes. võrgud või hinnake seda postitust:

(Hinnet pole veel)

Olen üldarst ja üldarst. Minu pädevusse kuuluvad patsientide varajase diagnoosimise ja paljude seedetrakti, kopsude ja hingamisteede, maksa, neerude, südame-veresoonkonna ja urogenitaalsüsteemi haiguste, nahahaiguste, ainevahetushäirete jm haiguste ravi. 15-aastane töökogemus üldarstina Moskva polikliinikud, millest 5 töötas ühes Peterburi haiglas .. Vastan hea meelega oma ajaveebi lugejate küsimustele.

Kaasaegses meditsiinis omistatakse suuremat tähtsust polümeraasi ahelreaktsioonil põhinevatele ülitäpsetele laboratoorsetele uurimismeetoditele. Tänu PCR-tehnoloogiate kasutamisele sai võimalikuks analüüsida molekulaargeneetilisel tasandil ning tuvastada pärilike ja nakkushaiguste ägedaid ja kroonilisi vorme patsiendil juba ammu enne kliiniliste sümptomite ilmnemist.

Mis on PCR - diagnostika

Selle meetodi töötas välja Ameerika biokeemik ja Nobeli preemia laureaat Carrie Mullis 1984. aastal.

Paljud kvalifitseeritud spetsialistid seisavad iga päev silmitsi PCR-uuringuga ega suuda ilma selle tulemusteta ette kujutada kõige aktiivsemate patoloogiate vormide täpset diagnoosi juhtudel, kui immunoloogilised ja mikrobioloogilised meetodid ei tööta. Sageli juhtub, et erinevad viirused võivad põhjustada samu kliinilisi sümptomeid, PCR-analüüs võimaldab teil määrata patogeeni selle madalaima kontsentratsiooniga biomaterjalis ja tuvastada isegi üksikuid viiruste või batsillide rakke.

PCR diagnostika kohta videol

PCR diagnostika aluseks on spetsiifilistes laboratoorsetes tingimustes DNA teatud lõikude (desoksüribonukleiinhape) korduva amplifikatsiooni (paljundamise) - inimese geneetilise materjali.

Kogu kopeerimise tehnoloogiline protsess koosneb mitmest etapist:

1. Denatureerimine – proovi ettevalmistamine, tõstes biomaterjali temperatuuri (kuni 95 °C), 2-ahelaline DNA jagatakse kaheks eraldi ahelaks.
2. Lõõmutamine - uuritav biomaterjal jahutatakse ja sellele lisatakse lämmastikupraimerid (reagendid), millel on võime DNA molekulis spetsiifiliselt ära tunda järjestusi, mis on iseloomulikud ainult patogeensele ainele ja nendega kombineerida.
3. pikenemised - polümeraasi reaktsioon ise, valmib ainulaadne molekulaargeneetiline sait, igas ühenduses praimeriga moodustub uus, struktuurselt täiendav tütar-DNA ahel.

Kogu tsüklit korratakse 20-30 korda. Lõppkokkuvõttes moodustub komplementaarsete DNA ahelate arv, mis on piisav visuaalseks analüüsiks ja tulemuste võrdlemiseks olemasolevate andmetega erinevate patogeenide rakustruktuuri kohta. Määratakse viirus, selle välimus, kehale avalduva toime tugevus ja batsillide arv. See teave on raviarsti jaoks väga kasulik tõhusate ravimeetodite määramisel ja ravimite valimisel.

PCR-diagnostika meetodid erinevad teistest laborimeetoditest järgmiste omaduste poolest:

• patogeenide olemasolu otsene määramine;
• viiruse tuvastamise protseduuri kõrge tundlikkus, spetsiifilisus ja mitmekülgsus;
• analüüsi kiirus;
• võime diagnoosida asümptomaatilised patoloogiad.

Uuringu tulemusi on võimalik pildistada või sisestada infokandjatele, et sõltumatud eksperdid saaksid neid hinnata.

Kuidas valmistuda PCR testiks?

Uurimiseks kasutatakse erinevaid biomaterjale:

• veri;
• lima;
• sülg
• uriin;
• röga;
• epiteeli kraapimine;
• eesnäärme mahl;
• limaskestade kraapimine;
• amnionivedelik;
• platsenta kude;
• tserebrospinaal-, liigese- või pleuravedelik;
• suguelundite sekretsioon.

Kaasaegne laboritehnika ja laborandi professionaalsus tagavad PCR analüüsi läbivale patsiendile usaldusväärse tulemuse. Kuid uuringu täpsus sõltub testi õigest ettevalmistamisest ja kõigi biomaterjali valimise soovituste järgimisest.

Analüüsiks pole keeruline korralikult valmistuda, oluline on järgida kõiki olemasolevaid reegleid:

1. Päev enne uuringut ärge astuge seksuaalvahekorda.
2. Tühista jõusaal.
3. Ärge külastage enne uuringut vanni ega sauna.
4. Õhtusöök peaks olema eelmisel päeval hiljemalt 20 tunni jooksul, ärge sööge vürtsikat ja rasvast toitu, ärge võtke alkoholi.
5. Veeniverd tuleb võtta hommikul, enne protseduuri ei tohi süüa, juua ega suitsetada.

Kuidas naised ja mehed PCR-teste teevad - protseduuri tunnused

Peamine üldnõue biomaterjali valikul on mikroorganismide maksimaalse kontsentratsiooni saavutamine proovis ja soovimatute lisandite – lima, vere või mäda – puudumine.

Seksuaalse kontakti kaudu levivate infektsioonide (ureaplasmoos, gardnerelloos, klamüüdia, mükoplasmoos, trihhomonoos) uuringute käigus võetakse genitaalidest sekretsiooni:

• meestel võetakse tampooni või kraapimine kuseteedest (ureetrast);
• naistel - määrimine või kraapimine tupest, emakakaela kanalist.

Urogenitaaltraktist materjali võtmisel on oluline vältida lisandite sissepääsu. Sel eesmärgil võetakse meestelt kraabid mitte varem kui 2 tundi pärast viimast urineerimist, naistelt - võttes arvesse menstruaaltsükli päevi. Üleliigne lima või mäda eemaldatakse steriilsete vatitupsudega, biomaterjal võetakse spetsiaalsete plastsondidega – see vähendab tõenäosust, et veri proovi siseneb.

Urogenitaalse kraapimise protseduur on meeste jaoks üsna valus. , mistõttu kasutatakse analüüsiks sageli esimest uriiniportsjonit pärast öist hilinemist, mis sisaldab kõige rohkem epiteeli. Uriin kogutakse tihedalt suletava kaanega steriilsesse anumasse ja toimetatakse laborisse hiljemalt kahe tunni jooksul pärast kogumist. Laboris saadakse edasiseks tööks tsentrifuugimise teel rakuline uriinisete.

Millised infektsioonid kuuluvad PCR-12 kompleksi?

PCR diagnostikat kasutavad aktiivselt kogenud spetsialistid. Kõige populaarsem on viiruste ja infektsioonide diagnoosimine.

Praegu avardavad polümeraasi ahelreaktsiooni meetodid uuringute läbiviimise võimalusi – genotüpiseerimise ja kudede DNA fragmentide splaissimise juurutamist kasutatakse laialdaselt Kaasaegse meditsiini erinevad valdkonnad:

• günekoloogia;
• uroloogia;
• pulmonoloogia;
• gastroenteroloogia;
• hematoloogia;
• onkoloogia.

Kust saab URFO-s odavaid teste saada?

Kaasaegsed PCR-diagnostika meetodid arenevad pidevalt. Tehnikat ennast täiustatakse, ilmuvad uut tüüpi PCR ja uued ahelreaktsiooni jaoks kasutatavad testimissüsteemid. Tänu nendele uuendustele muutub nende testide maksumus patsientidele taskukohasemaks.

PCR-määrikul nakkushaiguste diagnoosimisel on järgmised eelised:

• Nakkushaiguste patogeenide otsene avastamine.

Paljud traditsioonilised laboridiagnostika meetodid hõlmavad patogeenide tuvastamist erinevate kaudsete tunnuste järgi. Näiteks ELISA diagnostika põhineb nakkushaiguste patogeenide lagunemissaaduseks olevate valkude tuvastamisel patsiendi verest, mille põhjal saab arst teha konkreetse diagnoosi. PCR-analüüsi meetod näitab otseselt haiguse tekitaja DNA spetsiifilise piirkonna olemasolu patsiendilt võetud materjalis.

• PCR-diagnostika kõrge spetsiifilisus.

Analüüsi käigus eraldatakse uuritavast materjalist konkreetne DNA fragment, st omane ainult konkreetsele patogeenile – ainult teatud bakterile või viirusele. See DNA osa on ainulaadne ega ole iseloomulik ühelegi nakkusele maa peal.

• Kõrge tundlikkusega PCR.

Nakkuse tuvastamine on võimalik ka siis, kui patsiendilt võetud materjal sisaldab ainult ühte bakteri või viiruse rakku. Võrreldes teiste immunoloogiliste ja mikrobioloogiliste diagnostikameetoditega: PCR analüüsi tundlikkus on 10-100 rakku proovi kohta, teiste meetodite puhul 103-105 rakku.

0Massiiv ( => Analüüsid) Massiiv ( => 2) Massiiv ( =>.html) 2

• PCR analüüsi mitmekülgsus.

PCR-uuringute jaoks võib kasutada peaaegu kõiki materjale, sealhulgas neid, mis pole muude meetoditega uurimiseks kättesaadavad: lima, uriin, veri, seerum, röga, ejakulaat, epiteelirakkude kraapimine - kuna infektsioon võib sisalduda mis tahes bioloogilises sekretsioonis ja koed.

• PCR-analüüsi tulemuste saamise kiire kiirus.

Patsiendilt analüüsiks võetud materjali töötlemise ühtne meetod, reaktsiooniproduktide tuvastamine, automaatne PCR amplifikatsioon võimaldavad täieliku PCR-diagnoosi läbi viia 4-5 tunniga. Samal ajal kulub kultuuriuuringute meetoditele palju rohkem aega - mitmest päevast mitme nädalani, kuna patogeeni on vaja isoleerida ja seejärel rakukultuuris kasvatada.

• Võimalus diagnoosida mis tahes tüüpi infektsioone.

PCR-meetodi kõrge tundlikkus võimaldab diagnoosida infektsiooni mitte ainult haiguse ägedas staadiumis, vaid ka kroonilisi infektsioone ja isegi üksikute bakterite või viiruste esinemist.

PCR-määrimine võimaldab tuvastada nakkusi, mida taimestiku määrdumisel ei saa tuvastada: klamüüdia, ureaplasmoos, mükoplasmoos, genitaalherpes.

Olenemata sellest, kui oluline on uurimismeetod, on PCR-diagnostikal ka mõned piirangud. PCR-diagnostika puudused on järgmised:

• Võimalus saada valepositiivne tulemus

PCR-analüüs võib näidata positiivset tulemust isegi siis, kui infektsioon on juba surnud, antibiootikumide poolt "tapetud", kuid selle surnud rakud sisalduvad endiselt patsiendi kudedes. Kuidas on see võimalik? Väga lihtne. Näiteks infektsioon elab epiteelirakkudes (suguelundite või silmade limaskestal). Ja ta sai terveks. Kuid epiteelirakkude "uuendamine" võtab aega. Kui arst võtab materjali enne rakkude täieliku uuenemise perioodi, võib materjal sisaldada infektsiooni surnud rakke. Ilmselt sisaldavad rakud geneetilist materjali - patogeeni DNA-d või RNA-d, mis "otsib" PCR-i. PCR ei erista surnud rakke elavatest: see otsib DNA-d ja "kloonib" neid suurtes kogustes. Selle analüüsi tulemus on positiivne. Tegelikult on see valepositiivne.

PCR-i võimetus surnud nakkust elusast "eristada" seab PCR-i kasutamisel ja ravi efektiivsuse jälgimisel teatud nõuded. Peamine reegel on muidugi oodata, kuni nakkuse surnud jäänused on organismist täielikult eemaldatud, mis toimub keskmisel inimesel 4-8 nädala jooksul. Pärast seda perioodi, pärast viimase antibiootikumi tableti võtmist, saab ja tuleb kasutada PCR meetodit ravi efektiivsuse jälgimiseks.

gastroenteroloogia diagnostikakompleks - 5 360 rubla

AINULT MARTESäästa - 15%

1000 rubla EKG salvestamine koos tõlgendamisega

- 25%esmane
Arsti visiit
nädalavahetuse terapeut

980 hõõruda. esialgne hirudoterapeudi vastuvõtt

terapeudi vastuvõtt - 1130 rubla (1500 rubla asemel) „Ainult märtsikuus laupäeviti ja pühapäeviti perearsti vastuvõtt 25% soodustusega - 1500 rubla asemel 1130 rubla (diagnostika protseduurid tasutakse vastavalt hinnakirjale)

Varasematel perioodidel saab ravi kontrolli all hoida ainult kultiveerimismeetodi või nakatamise abil: ravimatuse märgiks võivad olla ainult elujõulised paljunevad mikroorganismid.

• PCR-analüüsi kasutamine gardnerelloosi diagnoosimiseks ei ole soovitav, kuna gardnerella, selle haiguse tekitajad, elab tupes tavaliselt vähesel määral. Nende bakterite DNA-d leitakse PCR-i kasutamisel ikka ja jälle. Gardnerellat ei tohiks määris olla ning bakterioskoopia on sel juhul piisav meetod gardnerelloosi diagnoosimiseks ja ravi jälgimiseks.
• Mikroorganismide varieeruvus

Igal mikroobil on võime muutuda ja seda DNA tasemel. Selle valdkonna kõige ilmekam näide on gripiviirus. Olles kord haige olnud, tekivad inimesel viirusevastased antikehad. Puhtteoreetiliselt on nii, et kui oleme vähemalt korra grippi põdenud, siis nagu tuulerõugeid, ei tohiks teist korda haigeks jääda. Aga me jääme peaaegu igal aastal haigeks. Mis on põhjus? Viirus "muteerub", veidi "muutades" oma genoomi ja meie immuunsüsteemi, meie antikehad ei "tunnista" enam ära vana külalist uues näos. Kahjuks peate uuesti grippi haigestuma ...

Võimendi (test PCR süsteemi) projekteerimisel kasutatakse antud mikroorganismile spetsiifilist DNA fragmenti, mis on muutustele kõige vähem vastuvõtlik. See on "valitud" DNA niinimetatud väga konserveerunud piirkonnast. Kuid mikroorganismide varieeruvus võib viia selleni, et mõned uuritava patogeeni genotüübid või tüved võivad genoomi amplifitseeritud (kloonitud) piirkonnas omandada mutatsioone ja muutuda seega selle katsesüsteemi jaoks tabamatuks.

Seega on erinevad testisüsteemid üheks põhjuseks, miks erinevates laborites ja erinevates kliinikutes “sama” PCR meetodil tehtud analüüsid võivad anda diametraalselt vastupidiseid tulemusi. Et mutatsioonivigu võimalikult palju vältida, on nüüdseks välja töötatud standardid, mis reguleerivad testimise ulatust (sealhulgas ristreaktsioonide testimine, samuti tuvastatava patogeeni teadaolevate tüvede testimine), mille testimissüsteem peab enne testimist läbima. turule ja seda kasutatakse teie tervise diagnoosimiseks. Seetõttu kasutavad head kliinikud ja laborid uusima põlvkonna testikomplekte. Ja meie meditsiinikeskus "Euromedprestige" on üks väheseid, kes suudab pakkuda oma klientidele kvaliteetset diagnostikat.

Polümeraasi ahelreaktsioon (lühidalt PCR) on kaasaegne ja ülitäpne diagnostiline meetod geneetilisel ja molekulaarsel tasandil. PCR diagnostika võimaldab kindlaks teha, kas inimesel on infektsioon või pärilik haigus.

Meetodi olemus seisneb selles, et uuringuks võetud materjali DNA või RNA allutatakse mitmekordsele paljundamisele (amplifikatsioonile), mis on võimalik ensüümide juuresolekul. Tänu sellele saadakse suur DNA või RNA mass, mille järgi tehakse visuaalne hinnang. Spetsialistide käsutuses on teabebaas kõigi haigustekitajate ehituse kohta ja vastavalt sellele antakse hinnang, milline mikroorganism saadi.

Uuritav materjal (sülg, veri, röga jne) asetatakse spetsiaalsesse seadmesse (võimendi) ja lisatakse teatud ensüümid. Need ühinevad uuritud DNA või RNA-ga ja põhjustavad nende koopiate sünteesi. PCR abil on võimalik määrata patogeeni tüüp, selle kogus.

Huvitav! PCR-meetodi leiutas 1983. aastal Ameerika teadlane Carrie Mullis. Selle avastuse eest pälvis ta Nobeli keemiaauhinna.

Katseklaasid katsematerjaliga

Plussid ja miinused

PCR-tehnikat on meditsiinis hiljuti kasutatud ja see on võtnud diagnostilises protsessis olulise koha.

Meetodi eelised:

1. Patogeeni otsene tuvastamine. Mõned meetodid, näiteks ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs, võimaldavad tuvastada mikroobide poolt sekreteeritud valke. See on patogeenide esinemise kaudne määratlus. Ja PCR abil tuvastatakse suure täpsusega teatud infektsioonile kuuluv DNA tükk.
2. Tehnika eripära. Kuna PCR tuvastab patogeenile kuuluva DNA, on vale järelduse tegemine peaaegu võimatu (v.a tundmatu patogeen). Ja immunoloogilise meetodi puhul võib antigeenide vahelise ristreaktsiooni tõttu tekkida viga.
3. Suur tundlikkus. Meetod tuvastab isegi väga väikese koguse bakterite või viiruste olemasolu organismis. Ühe proovi kohta piisab 10 haigust põhjustavast rakust. Muude meetodite puhul peab minimaalne lahtrite arv olema vähemalt 105.
4. Tehnika mitmekülgsus. Erinevate mikroorganismide uurimisprotsess on sarnane kogu DNA, RNA sarnasuse tõttu. Selle põhjal on võimalik ühes proovis tuvastada mitu patogeeni.
5. Kiire järeldus. Proovi võtmise hetkest kuni tulemuse saamiseni ei möödu rohkem kui 4-5 tundi. PCR-iga pole kultuuri vaja, seega on meetod üsna kiire.
6. Diagnostika tõhusus varjatud tüüpi infektsioonide korral. Meetod paljastab need mikroorganismid, mida on raske või üldse mitte kasvatada. Selliseid patogeene leidub haiguse varjatud vormides.
7. Lai kasutusala. PCR-i saab kasutada mitte ainult inimeste haiguste diagnoosimiseks, vaid ka mikroorganismide määramiseks pinnases, toidus, vees jne.

Kuid võite silmitsi seista ka PCR-meetodi puudustega:

1. Mikroobid võivad muutuda. Patogeenid võivad muutuda ja muteeruda. Seetõttu ei pruugi need olla PCR-iga tuvastatavad.
2. Võimalus paljundada mitte ainult elava, vaid ka surnud patogeeni DNA-d. Sellise olukorra vältimiseks saab PCR-i kasutada alles 1-2 kuud pärast eelmisest haigusest taastumist.

PCR-i sordid

Uurimismeetodit kasutatakse erinevatel eesmärkidel, seega on PCR-tehnikal erinevaid variante:

1. Pöördtranskriptsiooniga – kasutatakse korduvaks kahekordistamiseks ja järgnevaks määramiseks, milline RNA millisest mikroorganismist eraldati. Selleks kasutage erinevate patogeenide struktuuride andmete raamatukogu.
2. Pööratud – kasutatakse siis, kui teatud järjestuses on väike ala.
3. Pesastatud – kasutatakse soovimatute reaktsiooniproduktide hulga vähendamiseks. Sel eesmärgil viiakse läbi kaks järjestikust uuringut.
4. Asümmeetriline - kasutatakse juhul, kui teil on vaja suuremal määral korrutada ühte kõigist saadaolevatest DNA ahelatest.
5. Kvantitatiivne (reaalajas) - vajalik otseseks uurimiseks, kuidas saadud toote kogus muutub igas uues PCR-reaktsiooni tsüklis.
6. Digitaalne - kõige kaasaegsem ja täpsem.
7. Grupispetsiifiline - see on uuring, mis viiakse läbi peresidemete uurimiseks.
8. Astmeliselt – vähendab praimerite mittespetsiifilise interaktsiooni mõju.

Torude täitmine vereproovidega

Tulemuste dešifreerimine

Uuringu kokkuvõttes antakse ühemõtteline vastus patogeeni olemasolu kohta, mis juhtub:

• negatiivne, see tähendab, et infektsiooni pole;
• positiivne - see on.

Infektsiooni tuvastamine võib toimuda isegi siis, kui inimesel puuduvad haiguse sümptomid. See on nakkuse esialgne staadium. Mõnikord võite saada valepositiivse vastuse (negatiivse ja positiivse tulemuse piiril). Sel juhul tuleb analüüsi korrata. Erilist tähelepanu tuleks pöörata sellele, et materjal koguti täielikult kõigi nõuete kohaselt.

PCR analüüsi tähtajad

Praktikas saab uuringu tulemuse 2 päevaga. Mõnikord saab seda teha kiiremini – kohaletoimetamise päeval.

Protseduuri hind

PCR-i maksumus määratakse kindlaks selle järgi, millist infektsiooni testitakse. See sõltub ka testimise metoodikast. Analüüsi keskmine hind on vahemikus 200 kuni 850 rubla. Hind sisaldab ka tasu materjali kogumise eest - umbes 400 rubla.

PCR-testimise ligikaudsed hinnad.

Sageli pakuvad raviasutused õige väljaselgitamiseks analüüsida mitut infektsiooni korraga. Selline uuring maksab rohkem, kuid kaob vajadus täiendavate uuringute järele, mis säästab patsiendi aega.

Video "Polümeraasi ahelreaktsioon"

Video räägib PCR-meetodi olemusest ja selle eelistest. Filmis kanal SiberianMedicalLaboratory.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

PCR-meetodi olemus. DNA polümeraas

Polümeraasi ahelreaktsioon on molekulaarbioloogia eksperimentaalne meetod, mis võimaldab saavutada bioloogilises materjalis teatud nukleiinhappefragmentide väikeste kontsentratsioonide olulist suurenemist. Seda DNA koopiate arvu suurendamise protsessi nimetatakse võimendus. DNA kopeerimine PCR-i ajal toimub spetsiaalse ensüümi abil - polümeraas. DNA polümeraas (joonis 3) on ensüüm, mis osaleb DNA replikatsioonis (DNA amplifitseerimises elusorganismides). Selle klassi ensüümid katalüüsivad desoksüribonukleotiidide polümerisatsiooni piki DNA nukleotiidahelat, mida ensüüm "loeb" ja kasutab matriitsina. Uue nukleotiidi tüüp määratakse komplementaarsuse põhimõttega malliga, millest lugemine toimub.

DNA polümeraas lisab kokkupandud ahela 3 "otsa vabu nukleotiide. See viib ahela pikenemiseni 5"-3 suunas. Ükski teadaolevatest DNA polümeraasidest ei suuda luua ahelat "nullist": need on suudab lisada nukleotiide ainult juba olemasolevale 3"-hüdroksüülrühmale. Sel põhjusel vajab DNA polümeraas kruntvärv- lühike nukleotiidide järjestus (tavaliselt 20-25), mis on komplementaarne uuritava geeni lõpposadega - millele ta võiks lisada esimese nukleotiidi. Praimerid koosnevad alati DNA ja RNA alustest, kusjuures kaks esimest alust on alati RNA alused. Praimereid sünteesib teine ​​ensüüm - primaas. Teine ensüüm on helikaas- vajalik DNA kaksikheeliksi lahtikerimiseks üheahelalise struktuuri moodustamisega, mis tagab mõlema ahela replikatsiooni vastavalt DNA replikatsiooni poolkonservatiivsele mudelile.

Mõnedel DNA polümeraasidel on ka võime parandada vigu äsja kokkupandud DNA ahelas. Kui tuvastatakse vale nukleotiidipaar, veereb DNA polümeraas ühe sammu tagasi, eemaldab ahelast vale nukleotiidi, seejärel sisestab selle asemele õige, misjärel replikatsioon jätkub tavapäraselt.

PCR läbiviimine

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on DNA amplifikatsioonimeetod, mis suudab mõne tunni jooksul eraldada ja paljundada teatud DNA järjestust miljardeid kordi. Võimalus saada genoomi ühest rangelt määratletud piirkonnast tohutul hulgal koopiaid lihtsustab oluliselt olemasoleva DNA proovi uurimist.

Selleks, et polümeraasi ahelreaktsioon toimuks, peavad olema täidetud mitmed tingimused. PCR jaoks on kõige lihtsamal juhul vaja järgmisi komponente:

DNA matriits, mis sisaldab amplifitseeritavat DNA osa.

Kaks praimerit, mis on komplementaarsed soovitud fragmendi otstega. (Paar kunstlikult sünteesitud oligonukleotiide, mille suurus on tavaliselt 15–30 aluspaari ja mis on identsed sihtmärk-DNA vastavate piirkondadega. Neil on võtmeroll amplifikatsioonireaktsiooni produktide moodustumisel. Õigesti valitud praimerid tagavad testi spetsiifilisuse ja tundlikkuse süsteem.)

Termostabiilne DNA polümeraas. PCR-is kasutatav polümeraas peab püsima kõrgel temperatuuril aktiivne pikka aega, seetõttu kasutatakse termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus aquaticus (Taq polümeraas) jt.

Deoksünukleotiidtrifosfaadid (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polümeraasi tööks vajalikud Mg 2+ ioonid.

Puhverlahus, mis tagab vajalikud reaktsioonitingimused - pH, lahuse ioontugevus. Sisaldab soolasid, seerumi albumiini.

Et vältida reaktsioonisegu aurustumist, lisatakse katseklaasi kõrge keemistemperatuuriga õli, näiteks vaseliin. Kui kasutatakse soojendusega kaanega seadet, pole see vajalik.

Pürofosfataasi lisamine võib suurendada PCR reaktsiooni saagist. See ensüüm katalüüsib kasvavale DNA ahelale nukleotiidtrifosfaatide lisamisel tekkiva pürofosfaadi hüdrolüüsi ortofosfaadiks. Pürofosfaat võib inhibeerida PCR reaktsiooni.

Algse DNA koopiate arvu korrutamiseks on vaja tsüklilist reaktsiooni. Reeglina koosneb iga järjestikku korratav PCR-tsükkel kolmest etapist:

1. DNA denatureerimine ehk "sulatamine". Kaheahelalist DNA matriitsi kuumutatakse temperatuuril 94–96 °C (või 98 °C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5–2 minutiks, et võimaldada DNA ahelate eraldumist. Seda etappi nimetatakse denatureerimiseks, kuna vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel katkevad. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) reaktsioonisegu eelkuumutatakse 2–5 minutit, et matriit ja praimerid täielikult denatureerida. Seda lähenemist nimetatakse kuum start, võimaldab see vähendada mittespetsiifiliste reaktsiooniproduktide hulka.

2. Anniilimine – praimerite seondumine matriitsi DNA-ga. Kui kiud on eraldunud, alandatakse aeglaselt temperatuuri, et praimerid saaksid seonduda üheahelalise malliga. Lõõmutamistemperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt 50–65°C. Etapi aeg - 20 - 60 sekundit. Anniilimistemperatuuri vale valik põhjustab kas praimerite halva seondumise matriitsiga (kõrgendatud temperatuuril) või vales kohas seondumise ja mittespetsiifiliste saaduste ilmumise (madalal temperatuuril).

3. Süntees (ahela pikenemine). DNA polümeraas replitseerib matriitsi ahelat, kasutades praimerit "seemnena". Polümeraas alustab teise ahela sünteesi praimeri 3" otsast, mis on matriitsiga seotud ja liigub piki malli. Elongatsioonitemperatuur sõltub polümeraasist. Tavaliselt kasutatavad Taq ja Pfu polümeraasid on kõige aktiivsemad 72 °C juures. °C amplifitseeritava fragmendi pikkus Tavaliselt võetakse pikenemise ajaks üks minut iga tuhande aluspaari kohta Pärast kõigi tsüklite lõppu tehakse sageli täiendav etapp lõplik pikenemine et lõpetada kõik üheahelalised killud. See etapp kestab 7-10 minutit.

Seejärel korratakse denatureerimise, lõõmutamise ja pikenemise etappe mitu korda (30 või enam korda). Igas tsüklis kahekordistub DNA fragmendi sünteesitud koopiate arv.

Kõik reaktsioonid viiakse läbi termostaadiga sukeldatud katseklaasides. Temperatuurirežiimi muutmine ja selle hooldus toimub automaatselt.

Et täpselt mõista, kuidas teatud DNA segmendi amplifikatsioon PCR-i käigus toimub, on vaja selgelt mõista kõigi praimerite ja nende komplementaarsete järjestuste positsiooni amplifitseeritavates ahelates igas voorus. Esimeses voorus on iga äsja sünteesitud ahel palju pikem kui kaugus selle praimeri 3"-hüdroksüülrühmast teise praimeriga komplementaarse järjestuse terminaalse nukleotiidini. Selliseid ahelaid nimetatakse "pikateks mallideks". nende peal toimub edasine süntees.

Teises voorus denatureeritakse uuesti kaheahelaline DNA, mis koosneb sarnastest ja äsja sünteesitud (pikatest matriitsi) ahelatest ja seejärel anniilitakse praimeritega. Selle vooru sünteesi käigus sünteesitakse uuesti "pikad mallid" ja ka hulk ahelaid, mille ühes otsas on praimer ja teises otsas on teise praimeriga komplementaarne järjestus ("lühikesed mallid"). Kolmandas voorus denatureeritakse ja lõõmutatakse kõik varem moodustunud heterodupleksid samaaegselt praimeritega ning seejärel replitseeritakse. Järgmistes voorudes on "lühikeste maatriksite" arv järjest rohkem ja 30. vooruks on nende arv juba 10 6 korda suurem kui algahelate ehk "pikkade maatriksite" arv.

Spetsiifilise reaktsiooniprodukti kogus (piiratud praimeritega) suureneb teoreetiliselt proportsionaalselt 2 n-ni, kus n on reaktsioonitsüklite arv. Tegelikult võib iga tsükli efektiivsus olla alla 100%, nii et tegelikkuses:

kus P on produkti kogus, E on tsükli keskmine efektiivsus.

Kasvab ka "pikkade" DNA koopiate arv, kuid lineaarselt, seega domineerib reaktsiooniproduktides konkreetne fragment. Vajaliku produkti kasvu piiravad eksponentsiaalselt reaktiivide hulk, inhibiitorite olemasolu ja kõrvalsaaduste teke.

PCR on väga tundlik meetod, mistõttu kui testitavas proovis on kasvõi ebaoluline kogus kogemata ühest reaktsioonisegust teise sattunud DNA-d, võib saada valepositiivseid tulemusi. Seetõttu on vaja hoolikalt kontrollida kõiki PCR-i jaoks kasutatavaid lahuseid ja tööriistu.

Praimeri valiku põhiprintsiibid.

PCR-testisüsteemi loomisel on üks peamisi ülesandeid praimerite õige valimine, mis peavad vastama mitmele kriteeriumile:

1. Praimerid peavad olema spetsiifilised. Erilist tähelepanu pööratakse praimerite 3"-otstele, kuna just nendest hakkab Taq polümeraas täiendama DNA ahelat. Kui nende spetsiifilisus on ebapiisav, siis on tõenäoline, et katseklaasis toimuvad ebasoovitavad protsessid. reaktsioonisegu, nimelt mittespetsiifilise DNA süntees (lühikesed või pikad fragmendid).See on elektroforeesil nähtav raskete või kergete lisaribadena.See muudab reaktsiooni tulemuste hindamise keeruliseks, kuna lihtne segi ajada spetsiifilist amplifikatsiooniprodukti sünteesitud võõr-DNA-ga.Osa praimereid ja dNTP-sid kulutatakse mittespetsiifilise DNA sünteesiks, mis toob kaasa märkimisväärse tundlikkuse kaotuse.

2. Praimerid ei tohiks moodustada dimeere ja silmuseid, st. praimerite enda või üksteise külge anniilimisel ei tohiks moodustada stabiilseid topeltkiude.