PCR materiaali. polymeraasiketjureaktio

Nykyaikaiset korkean teknologian laboratoriotutkimuksen menetelmät mahdollistavat sairauksien tunnistamisen varhaisessa vaiheessa. Tartuntataudit kehittyvät ja kehittyvät, niitä tulee yhä enemmän ja niitä on yhä vaikeampi tunnistaa. Diagnoosi PCR:llä (polymeraasiketjureaktio) on yksi uusimmista ja tarkimmista. Sen kehittämisestä tiedemies Kary Mullis sai Nobel-palkinnon.

polymeraasiketjureaktio- molekyyligeneettisen diagnostiikan menetelmä, jonka avulla voit löytää erityyppisiä tarttuvia ja perinnöllisiä patologioita ihmisillä, sekä akuuteissa että kroonisissa muodoissa, ja kauan ennen kuin patologia alkaa ilmetä. Useimmat lääkärit kohtaavat tämän analyysin joka päivä, eivätkä enää kuvittele, kuinka on mahdollista tehdä oikea diagnoosi ja taudin vaihe ilman sitä.

PCR-diagnostiikan ydin

PCR-analyysissä käytetään molekyylibiologian periaatteita. Toteutuksen aikana käytetään erityisiä entsyymejä, jotka kopioivat toistuvasti RNA- ja DNA-fragmentteja sekä sairauksia aiheuttavia mikro-organismeja, joita löytyy ihmisen biologisista materiaaleista. Kopiointi tapahtuu useissa vaiheissa, joten muodostuu ketjureaktio. Tämän jälkeen laboratorion asiantuntijat tarkistavat saamansa tiedot yhteisellä tietokannalla ja tunnistavat taudin aiheuttajat ja niiden pitoisuuden. Diagnostiikka suoritetaan erityisessä laitteessa, joka jäähdyttää ja lämmittää koeputkea biomateriaalilla ja jota kutsutaan vahvistimeksi. Lämpötilajärjestelmän noudattaminen vaikuttaa analyysitulosten todenperäisyyteen.

Mikro-organismien DNA-fragmentteja voi sisältyä seuraaviin biologisiin materiaaleihin:

• biologiset nesteet;
• veri ja sen johdannaiset;
• epiteelisolujen kaapiminen tai sively;
• virtsa;
• yskös;
• lima ja muut biologiset eritteet;
• maha-suolikanavan limakalvon biopaatit.

Missä PCR-diagnostiikkaa käytetään?

Polymeraasiketjureaktion avulla tartuntatautien diagnosointimahdollisuudet ovat suuret, sillä voidaan tunnistaa monenlaisia ​​infektioita aiheuttavia viruksia, kuten:

Tämä ei ole täydellinen luettelo sairauksista, jotka havaitaan PCR-analyysillä. Useimmat näistä patologioista ovat varhaisessa vaiheessa lähes näkymättömiä, mutta niiden vaikutuksen seuraukset kehoon ovat erittäin kielteisiä ja usein vaarallisia ihmisten terveydelle ja elämälle.

Raskaana oleville naisille määrätään PCR-testi sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden havaitsemiseksi, mikä lisää merkittävästi kohdunkaulan syövän riskiä ja vaikuttaa haitallisesti raskauden kulumiseen ja lapsen terveyteen. Siksi sukupuolitautien diagnosointi on erittäin tärkeää, jotta estetään sikiön tartunnat patogeenisilla mikro-organismeilla.

Kaiken edellä esitetyn perusteella voimme päätellä, että PCR-menetelmää käyttävä laboratoriodiagnostiikka auttaa lääkäriä tekemään tarkan diagnoosin ja määräämään tehokkaan hoidon jokaisessa yksittäistapauksessa.

Se on kiinnostavaa! PCR-menetelmää käytetään lääketieteen lisäksi myös muilla aloilla, esimerkiksi oikeuslääketieteessä, kun on tarpeen selvittää, kuka omistaa rikospaikalta löydetyn biomateriaalin, ja joskus PCR-menetelmää käytetään isyyden määrittämiseen, kokeiden tekemiseen DNA-mutaatiot ja muut kokeet.

Menetelmän plussat ja miinukset

PCR-diagnostiikan edut ovat:

• testin korkea herkkyys mahdollistaa jopa yksittäisten patogeenin tekijöiden määrittämisen, mikä mahdollistaa patologian havaitsemisen varhaisessa vaiheessa kroonisella ja piilevällä muodolla;
• menetelmän monipuolisuus mahdollistaa lähes minkä tahansa biomateriaalin käytön tutkimukseen syljestä ihosoluihin;
• suuri kattavuus - tutkimalla yhtä näytettä on mahdollista määrittää useiden eri patogeenien esiintyminen;
• tarkkuus - tämän tutkimusmenetelmän korkea taso antaa sinun olla antamatta vääriä indikaattoreita;
• nopeus - tulos on valmis keskimäärin viidessä tunnissa, eli potilas voi ottaa johtopäätöksen jo seuraavana päivänä biomateriaalin toimituksen jälkeen;
• suhteellisen alhainen hinta - tämä diagnostinen menetelmä ei eroa kustannuksiltaan muista laboratorioverikokeista;
• Tällä menetelmällä on mahdollista tehdä prekliinistä ja retrospektiivistä diagnostiikkaa. Ensimmäinen havaitsee patogeeniset mikro-organismit jo ennen taudin ilmenemistä, ja toinen suoritetaan patologian siirron jälkeen, mikä mahdollistaa patologian kehittymisen estämisen ja sen parantamisen ajoissa sekä taudin määrittämisen. taudin piilevä muoto, joka ilmenee ilman ilmeisiä oireita.

Mutta täydellisiä diagnostisia menetelmiä ei ole olemassa, joten PCR:llä on haittoja:

• korkeat vaatimukset teknologisen prosessin noudattamiselle;
• korkeat vaatimukset laboranttien ammattitaidolle.

Neuvoja! On parempi suorittaa tällainen analyysi vain parhaissa ja ammattimaisimmissa laboratorioissa, joissa on otettu käyttöön tiukat laadunvalvontajärjestelmät.

Tulosten luotettavuuden vuoksi on tarpeen noudattaa analyysin alustavan valmistelun sääntöjä:

• kun annat sylkeä, sinun ei pitäisi syödä ja juoda lääkkeitä neljä tuntia ennen analyysiä, ennen toimenpidettä, huuhtele suusi keitetyllä vedellä ja suorita sitten pieni ihohieronta salaisuuden erittämiseksi rauhasesta;
• virtsa kerätään yleensä kotona. Ennen tätä on tarpeen pestä sukuelimet ja kerätä 50 ml ensimmäistä aamuvirtsaa erityiseen astiaan; materiaalia ei ole suositeltavaa kerätä kuukautisten aikana;
• Ennen siittiöiden luovuttamista mies ei saa harrastaa seksiä kolmeen päivään, ei saa mennä saunaan, uida kuumassa kylvyssä, juoda alkoholijuomia ja mausteista ruokaa. Välittömästi ennen analyysiä on kielletty virtsata kolmen tunnin ajan;
• urogenitaalinäytteen antamista varten suositellaan kolmen päivän poissaoloa sukupuoliyhteydestä. Antibakteeriset lääkkeet ovat kiellettyjä kaksi viikkoa ennen analyysiä. Viikon ajaksi sinun on lopetettava intiimigeelien, voiteiden, emättimen peräpuikkojen käyttö, äläkä suihkuta. Kolme tuntia ennen biomateriaalin ottamista on vältettävä käymästä wc: ssä.
• veri annetaan aamulla tyhjään vatsaan.

Diagnostista materiaalia tulee kerätä olosuhteissa, jotka sulkevat pois sen kontaminoitumisen, koska tämä voi merkittävästi vaikuttaa PCR-tuloksen todenperäisyyteen.

Analyysin purkaminen

Analyysi voi näyttää positiivisen tai negatiivisen tuloksen. Negatiivinen tarkoittaa, että kehossa ei ole epäiltyjä infektioita ja henkilö on terve. Positiivinen kertoo, että potilas on sairas ja tarvitsee hoitoa. Lääkärin on tulkittava ja ilmaistava kaikki indikaattorit. Sinun ei pitäisi olla järkyttynyt ja pelätä huonoja tuloksia, terapia määrätään niiden perusteella, tärkeintä ei ole viivyttää prosessia eikä itsehoitoa.

Piditkö artikkelistamme? Jaa ystävien kanssa sosiaalisessa mediassa. verkot tai arvioi tämä viesti:

(Ei vielä arvioita)

Olen yleislääkäri ja yleislääkäri. Osaamisalueeseeni kuuluvat potilaiden varhainen diagnosointi ja monien maha-suolikanavan, keuhkojen ja hengitysteiden, maksan, munuaisten, sydän- ja verisuoni- ja virtsaelinten sairauksien, ihosairauksien, aineenvaihduntahäiriöiden jne. sairauksien hoito. 15 vuoden kokemus yleislääkärinä Moskovan poliklinikat, joista 5 työskenteli yhdessä sairaalassa Pietarissa .. Vastaan ​​mielelläni blogini lukijoiden kysymyksiin.

Nykylääketieteessä painotetaan entistä enemmän polymeraasiketjureaktioon perustuvia korkean tarkkuuden laboratoriotutkimusmenetelmiä. PCR-tekniikoiden käytön ansiosta on mahdollista analysoida molekyyligeneettisellä tasolla ja tunnistaa potilaan perinnöllisten ja infektiosairauksien akuutit ja krooniset muodot kauan ennen kliinisten oireiden ilmaantumista.

Mikä on PCR - diagnostiikka

Tämän menetelmän kehitti amerikkalainen biokemisti ja Nobel-palkittu Carrie Mullis vuonna 1984.

Monet pätevät asiantuntijat kohtaavat PCR-tutkimuksen päivittäin, eivätkä voi kuvitella ilman sen tuloksia tarkkaa diagnoosia aktiivisimmista patologiamuodoista tapauksissa, joissa immunologiset ja mikrobiologiset menetelmät eivät toimi. Usein käy niin, että eri virukset voivat aiheuttaa samoja kliinisiä oireita, PCR-analyysin avulla voit määrittää patogeenin sen pienimmällä pitoisuudella biomateriaalissa ja tunnistaa jopa yksittäiset virus- tai basillisolut.

Tietoja PCR-diagnostiikasta videolla

PCR-diagnostiikan perusta on erityisissä laboratorio-olosuhteissa tiettyjen DNA-osien (deoksiribonukleiinihapon) - ihmisen geneettisen materiaalin - toistuvan monistamisen (kertymisen).

Koko kopioinnin tekninen prosessi koostuu useista vaiheista:

1. Denaturaatio – näytteen valmistelu nostamalla biomateriaalin lämpötilaa (95 °C asti), 2-juosteinen DNA jaetaan kahdeksi erilliseksi juosteeksi.
2. Hehkutus - tutkittu biomateriaali jäähdytetään ja siihen lisätään typpialukkeita (reagensseja), joilla on kyky tunnistaa DNA-molekyylissä vain taudinaiheuttajalle ominaisia ​​sekvenssejä ja yhdistyä niihin.
3. venymät - itse polymeraasireaktio, ainutlaatuinen molekyyligeneettinen kohta valmistuu, jokaisessa yhteydessä alukkeen kanssa muodostuu uusi, rakenteellisesti täydentävä tytär-DNA-ketju.

Koko sykli toistetaan 20-30 kertaa. Lopulta muodostuu komplementaarisia DNA-juosteita, joka riittää visuaaliseen analyysiin ja tulosten vertailuun eri patogeenien solurakenteesta saatavilla olevaan tietoon. Virus määritetään, sen ulkonäön luonne, sen vaikutuksen voimakkuus kehoon ja läsnä olevien basillien määrä. Nämä tiedot ovat erittäin tärkeitä hoitavalle lääkärille, kun hän määrää tehokkaita hoitomenetelmiä ja valitsee lääkkeitä.

PCR-diagnostiikkamenetelmät eroavat muista laboratoriomenetelmistä seuraavissa asioissa:

• patogeenien esiintymisen suora määrittäminen;
• virusten havaitsemismenettelyn korkea herkkyys, spesifisyys ja monipuolisuus;
• analyysin nopeus;
• kyky diagnosoida oireettomia patologioita.

Tutkimuksen tulokset voidaan valokuvata tai syöttää tietovälineisiin riippumattomien asiantuntijoiden arvioitavaksi.

Kuinka valmistautua PCR-testiin?

Tutkimuksessa käytetään erilaisia ​​biomateriaaleja:

• veri;
• lima;
• sylki
• virtsa;
• yskös;
• epiteelin raapiminen;
• eturauhasen mehu;
• limakalvojen raapiminen;
• lapsivesi;
• istukan kudos;
• aivo-selkäydin-, nivel- tai pleuraneste;
• sukuelinten eritys.

Nykyaikaiset laboratoriolaitteet ja laboratorion avustajan ammattitaito takaavat, että PCR-analyysin läpikäyvä potilas saa luotettavan tuloksen. Mutta tutkimuksen tarkkuus riippuu testin oikeasta valmistelusta ja kaikkien biomateriaalin valintaa koskevien suositusten noudattamisesta.

Ei ole vaikeaa valmistautua kunnolla analyysiin, on tärkeää noudattaa kaikkia olemassa olevia sääntöjä:

1. Tutkimusta edeltävänä päivänä älä ole seksuaalisessa kanssakäymisessä.
2. Peruuta kuntosali.
3. Älä käy kylvyssä tai saunassa ennen tutkimusta.
4. Sinun tulisi syödä illallista edellisenä päivänä viimeistään 20 tuntia, älä sekaannu mausteiseen ja rasvaiseen ruokaan, älä ota alkoholia.
5. Laskimoveri tulee ottaa aamulla, älä syö, juo tai tupakoi ennen toimenpidettä.

Kuinka naiset ja miehet ottavat PCR-testejä - menettelyn ominaisuudet

Pääasiallinen yleinen vaatimus biomateriaalin valinnassa on saada mahdollisimman suuri mikro-organismien pitoisuus näytteessä ja ei-toivottujen epäpuhtauksien - liman, veren tai mätä - puuttuminen.

Sukupuoliyhteyden kautta tarttuvien infektioiden (ureaplasmoosi, gardnerelloosi, klamydia, mykoplasmoosi, trikomoniaasi) tutkimuksissa otetaan eritteitä sukuelimistä:

• miehillä vanupuikko tai raavi otetaan virtsakanavasta (virtsaputkesta);
• naisilla - sively tai raapiminen emättimestä, kohdunkaulan kanavasta.

Kun materiaalia otetaan virtsa- ja sukuelinten kautta, on tärkeää välttää epäpuhtauksien pääsyä sisään. Tätä tarkoitusta varten miehiltä otetaan kaavinta aikaisintaan 2 tuntia viimeisen virtsaamisen jälkeen, naisilta - kuukautiskierron päivät huomioon ottaen. Ylimääräinen lima tai mätä poistetaan steriileillä pumpulipuikoilla, biomateriaali otetaan erityisillä muovisilla antureilla - tämä vähentää veren pääsyn todennäköisyyttä näytteeseen.

Urogenitaalisen kaavin ottaminen on miehille melko tuskallista. , minkä vuoksi analyysiin käytetään usein ensimmäistä virtsaa yöviiveen jälkeen, joka sisältää suurimman määrän epiteeliä. Virtsa kerätään steriiliin astiaan, jossa on tiivis kansi ja toimitetaan laboratorioon viimeistään kahden tunnin kuluttua keräämisestä. Laboratoriossa jatkotyötä varten saadaan sentrifugoimalla solumainen virtsan sedimentti.

Mitä infektioita PCR-12-kompleksi sisältää?

Kokeneet asiantuntijat käyttävät aktiivisesti PCR-diagnostiikkaa. Suosituin on virusten ja infektioiden diagnosointi.

Tällä hetkellä polymeraasiketjureaktion menetelmät laajentavat tutkimuksen tekemisen mahdollisuuksia - genotyypityksen ja kudosten DNA-fragmenttien silmukoinnin käyttöönotto on laajalti käytössä modernin lääketieteen eri osa-alueet:

• gynekologia;
• urologia;
• pulmonologia;
• gastroenterologia;
• hematologia;
• onkologia.

Mistä saan edullisia testejä URFOssa?

Nykyaikaiset PCR-diagnostiikan menetelmät kehittyvät jatkuvasti. Itse tekniikkaa parannetaan, uusia PCR-tyyppejä ja uusia ketjureaktioon käytettäviä testijärjestelmiä on tulossa. Näiden innovaatioiden ansiosta näiden testien kustannukset tulevat potilaille edullisemmiksi.

PCR-näytteellä tartuntatautien diagnosoinnissa on seuraavat edut:

• Tartuntatautien patogeenien suora havaitseminen.

Monet perinteiset laboratoriodiagnostiikan menetelmät sisältävät taudinaiheuttajien tunnistamisen erilaisten epäsuorien merkkien perusteella. Esimerkiksi ELISA-diagnostiikka perustuu tartuntatautien aiheuttajien hajoamistuotteita olevien proteiinien havaitsemiseen potilaan verestä, jonka perusteella lääkäri voi tehdä tietyn diagnoosin. PCR-analyysimenetelmä antaa suoran osoituksen sairauden aiheuttajan DNA:n tietyn alueen esiintymisestä potilaasta otetussa materiaalissa.

• PCR-diagnostiikan korkea spesifisyys.

Analyysin aikana testimateriaalista eristetään spesifinen DNA-fragmentti, eli se on ominaista vain tietylle patogeenille - vain tietylle bakteerille tai virukselle. Tämä DNA-osio on ainutlaatuinen, eikä se ole tyypillistä millekään maan päällä olevalle infektiolle.

• Erittäin herkkä PCR.

Infektion havaitseminen on mahdollista, vaikka potilaalta otetussa materiaalissa olisi vain yksi bakteeri- tai virussolu. Verrattuna muihin immunologisiin ja mikrobiologisiin diagnostisiin menetelmiin: PCR-analyysin herkkyys on 10-100 solua näytettä kohti, muut menetelmät - 103-105 solua.

0Matriisi ( => Analyysit) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

• PCR-analyysin monipuolisuus.

PCR-tutkimukseen voidaan käyttää melkein mitä tahansa materiaalia, myös sellaisia, joita ei ole saatavilla muilla menetelmillä: limaa, virtsaa, verta, seerumia, ysköstä, siemensyöksyä, epiteelisolujen raapimista - koska infektio voi sisältyä mihin tahansa biologiseen eritteeseen ja kudoksia.

• Suuri nopeus PCR-analyysin tuloksen saamiseksi.

Yksittäinen menetelmä potilaalta analyysiin otetun materiaalin käsittelemiseksi, reaktiotuotteiden havaitseminen, automaattinen PCR-monistus mahdollistavat täydellisen PCR-diagnoosin suorittamisen 4-5 tunnissa. Samaan aikaan kulttuurin tutkimusmenetelmiin kuluu paljon enemmän aikaa - useista päivistä useisiin viikkoihin, koska patogeeni on eristettävä ja kasvatettava soluviljelmässä.

• Kyky diagnosoida minkä tahansa tyyppinen infektio.

PCR-menetelmän korkea herkkyys mahdollistaa infektion diagnosoinnin paitsi taudin akuutissa vaiheessa myös kroonisten infektioiden ja jopa yksittäisten bakteerien tai virusten esiintymisen.

PCR-näytteen avulla voit tunnistaa infektiot, joita ei voida havaita kasvistonäytteestä: klamydia, ureaplasmoosi, mykoplasmoosi, sukuelinten herpes.

Riippumatta siitä, kuinka merkittävä tutkimusmenetelmä on, PCR-diagnostiikassa on myös joitain rajoituksia. PCR-diagnostiikan haittoja ovat:

• Mahdollisuus saada väärä positiivinen tulos

PCR-analyysi voi osoittaa positiivisen tuloksen, vaikka infektio olisi jo kuollut, antibioottien "tappama", mutta sen kuolleet solut ovat edelleen potilaan kudoksissa. Kuinka tämä on mahdollista? Erittäin yksinkertainen. Esimerkiksi infektio elää epiteelisoluissa (sukuelinten tai silmien limakalvolla). Ja hän parani. Mutta epiteelisolujen "uusiminen" vie aikaa. Jos lääkäri ottaa materiaalin ennen solujen täydellistä uusiutumista, materiaali saattaa sisältää infektion kuolleita soluja. Solut sisältävät ilmeisesti geneettistä materiaalia - patogeenin DNA:ta tai RNA:ta, joka "etsii" PCR:ää. PCR ei erota kuolleita soluja elävistä: se etsii DNA:ta ja "kloonaa" niitä suuria määriä. Tämän analyysin tulos on positiivinen. Itse asiassa se on väärä positiivinen.

PCR:n kyvyttömyys "erottaa" kuollutta infektiota elävästä asettaa tiettyjä vaatimuksia PCR:ää käytettäessä ja hoidon tehokkuuden seurannassa. Pääsääntö on tietysti odottaa, kunnes infektion kuolleet jäännökset poistuvat kokonaan kehosta, mikä tapahtuu tavallisella ihmisellä 4-8 viikossa. Tämän ajanjakson jälkeen, viimeisen antibioottitabletin ottamisen jälkeen, PCR-menetelmää voidaan ja tulee käyttää hoidon tehokkuuden seuraamiseen.

gastroenterologia diagnostinen kompleksi - 5 360 ruplaa

VAIN MARTESäästä - 15%

1000 ruplaa EKG-tallennus tulkinnalla

- 25%ensisijainen
Lääkärin käynti
viikonloppu terapeutti

980 hieroa. ensimmäinen hirudoterapeutin tapaaminen

terapeutin tapaaminen - 1 130 ruplaa (1 500 ruplan sijaan) "Vain maaliskuussa lauantaisin ja sunnuntaisin aika yleislääkärille 25% alennuksella - 1130 ruplaa 1500 ruplan sijasta (diagnostiikkatoimenpiteet maksetaan hinnaston mukaan)

Aikaisemmilla jaksoilla paranemisen hallinta voidaan suorittaa vain viljelymenetelmällä eli rokotuksella: vain elinkykyiset lisääntyvät mikro-organismit voivat toimia merkkinä parantumattomuudesta.

• PCR-analyysiä ei ole toivottavaa käyttää gardnerelloosin diagnosointiin, koska gardnerellaa, tämän taudin aiheuttajia, elää normaalisti emättimessä pieniä määriä. Näiden bakteerien DNA löydetään PCR:ää käytettäessä yhä uudelleen ja uudelleen. Gardnerellaa ei saa olla näytteessä, ja bakterioskopia on tässä tapauksessa riittävä menetelmä gardnerelloosin diagnosointiin ja hoidon seurantaan.
• Mikro-organismien vaihtelu

Jokaisella mikrobilla on kyky muuttua ja DNA-tasolla. Silmiinpistävin esimerkki tällä alalla on influenssavirus. Kerran sairastettuaan ihminen kehittää vasta-aineita virukselle. Puhtaasti teoreettisesti, jos meillä on ollut flunssa vähintään kerran, niin vesirokon tapaan meidän ei pitäisi sairastua toista kertaa. Mutta sairastumme melkein joka vuosi. Mikä on syy? Virus "mutatoi", "muuttaa" hieman genomiaan ja immuunijärjestelmäämme, vasta-aineemme eivät enää "tunnista" vanhaa vierasta uudessa asussa. Valitettavasti joudut taas sairastumaan flunssaan...

Vahvistimen (testi-PCR-järjestelmän) suunnittelussa käytetään tietylle mikro-organismille spesifistä DNA-fragmenttia, joka on vähiten herkkä muutoksille. Se on "valittu" DNA:n niin kutsutusta erittäin konservoituneesta alueesta. Mikro-organismien vaihtelevuus voi kuitenkin johtaa siihen, että jotkin tutkittavan patogeenin genotyypit tai kannat voivat saada mutaatioita genomin monistetulla (kloonatulla) alueella ja siten tulla vaikeasti tämän testijärjestelmän avulla.

Erilaiset testijärjestelmät ovat siis yksi syy, miksi eri laboratorioissa ja eri klinikoilla "samalla" PCR-menetelmällä tehdyt analyysit voivat antaa täysin päinvastaisia ​​tuloksia. Mutaatiovirheiden välttämiseksi mahdollisimman paljon on nyt kehitetty standardeja, jotka säätelevät testauksen laajuutta (mukaan lukien ristireaktioiden testaus sekä havaittavissa olevan patogeenin tunnettujen kantojen testaus), jotka testijärjestelmän on läpäistävä ennen sitä. tulee markkinoille ja sitä käytetään terveytesi diagnosointiin. Siksi hyvät klinikat ja laboratoriot käyttävät uusimman sukupolven testisarjoja. Ja terveyskeskuksemme "Euromedprestige" on yksi harvoista, jotka voivat tarjota asiakkailleen korkealaatuista diagnostiikkaa.

Polymeraasiketjureaktio (lyhyesti PCR) on moderni ja erittäin tarkka diagnostinen menetelmä geneettisellä ja molekyylitasolla. PCR-diagnostiikan avulla voidaan määrittää, onko henkilöllä infektio vai perinnöllinen sairaus.

Menetelmän ydin on siinä, että tutkimukseen otetun materiaalin DNA tai RNA altistetaan moninkertaiselle (amplifikaatiolle), joka on mahdollista entsyymien läsnä ollessa. Tästä johtuen saadaan suuri massa DNA:ta tai RNA:ta, jonka mukaan tehdään visuaalinen arvio. Asiantuntijoilla on tietokanta kaikkien taudinaiheuttajien rakenteesta ja sen mukaisesti arvioidaan, mikä mikro-organismi on saatu.

Testimateriaali (sylki, veri, yskös jne.) asetetaan erityiseen laitteeseen (vahvistimeen) ja lisätään tiettyjä entsyymejä. Ne yhdistyvät tutkitun DNA:n tai RNA:n kanssa ja aiheuttavat niiden kopioiden synteesin. PCR:n avulla on mahdollista määrittää patogeenin tyyppi, sen määrä.

Mielenkiintoista! Amerikkalainen tiedemies Carrie Mullis keksi PCR-menetelmän vuonna 1983. Tästä löydöstä hänelle myönnettiin kemian Nobel-palkinto.

Koeputket testimateriaalilla

Hyvät ja huonot puolet

PCR-tekniikkaa on käytetty lääketieteen alalla viime aikoina, ja se on ottanut tärkeän paikan diagnostisessa prosessissa.

Menetelmän edut:

1. Patogeenin suora tunnistaminen. Jotkut menetelmät, esimerkiksi entsyymi-immunosorbenttimääritys, mahdollistavat mikrobien erittämien proteiinien tunnistamisen. Tämä on epäsuora määritelmä patogeenien esiintymisestä. Ja PCR:n avulla tiettyyn infektioon kuuluva DNA-pala havaitaan suurella tarkkuudella.
2. Tekniikan erityispiirteet. Koska PCR havaitsee taudinaiheuttajalle kuuluvan DNA:n, on lähes mahdotonta tehdä väärää johtopäätöstä (lukuun ottamatta tuntematonta taudinaiheuttajaa). Ja immunologisella menetelmällä voi tapahtua virhe antigeenien välisen ristireaktion vuoksi.
3. Suuri herkkyys. Menetelmä havaitsee jopa hyvin pienen määrän bakteereita tai viruksia kehossa. 10 taudin aiheuttavaa solua näytettä kohti riittää. Muissa menetelmissä solujen vähimmäismäärän on oltava vähintään 105.
4. Tekniikan monipuolisuus. Eri mikro-organismien tutkimusprosessi on samanlainen, koska kaikki DNA, RNA on samankaltaisia. Tämän perusteella on mahdollista tunnistaa useita taudinaiheuttajia yhdestä näytteestä.
5. Nopea johtopäätös. Näytteenottohetkestä tuloksen saamiseen kuluu enintään 4-5 tuntia. PCR:llä viljelyä ei tarvita, joten menetelmä on melko nopea.
6. Diagnoosin tehokkuus piilevien infektiotyyppien yhteydessä. Menetelmä paljastaa ne mikro-organismit, jotka ovat vaikeita tai eivät ollenkaan viljelykelpoisia. Tällaisia ​​taudinaiheuttajia löytyy taudin piilevistä muodoista.
7. Laaja käyttöalue. PCR:ää voidaan käyttää paitsi ihmisten sairauksien diagnosoimiseen, myös mikro-organismien määrittämiseen maaperässä, ruoassa, vedessä jne.

Mutta voit myös kohdata PCR-menetelmän haitat:

1. Mikrobit voivat muuttua. Patogeenit voivat muuttua ja muuntua. Siksi niitä ei ehkä voida havaita PCR:llä.
2. Mahdollisuus moninkertaistaa paitsi elävän myös kuolleen patogeenin DNA. Tällaisen tilanteen välttämiseksi PCR:ää voidaan käyttää vain 1-2 kuukautta edellisestä sairaudesta toipumisen jälkeen.

PCR-lajikkeet

Tutkimusmenetelmää käytetään useisiin tarkoituksiin, joten PCR-tekniikalla on erilaisia:

1. Käänteistranskriptiolla - käytetään toistuvaan kaksinkertaistamiseen ja myöhempään sen määrittämiseen, mikä mikro-organismin RNA eristettiin. Käytä tätä varten tietokirjastoa eri patogeenien rakenteista.
2. Käänteinen - käytetään, kun tietyssä sarjassa on pieni alue.
3. Sisäkkäinen - käytetään vähentämään ei-toivottujen reaktiotuotteiden määrää. Näitä tarkoituksia varten tehdään kaksi peräkkäistä tutkimusta.
4. Epäsymmetrinen - käytetään, jos joudut lisäämään yhtä kaikista käytettävissä olevista DNA-ketjuista.
5. Kvantitatiivinen (reaaliaikainen) - tarvitaan suoraa tutkimusta varten siitä, kuinka saadun tuotteen määrä muuttuu jokaisessa uudessa PCR-reaktion syklissä.
6. Digitaalinen - modernein ja tarkin.
7. Ryhmäkohtainen - tämä on tutkimus, joka tehdään perhesiteiden tutkimiseksi.
8. Vaiheittainen - vähentää alukkeiden epäspesifisen vuorovaikutuksen vaikutusta.

Putkien täyttäminen verinäytteillä

Tulosten purkaminen

Tutkimuksen johtopäätöksessä annetaan yksiselitteinen vastaus taudinaiheuttajan läsnäolosta, jota tapahtuu:

• negatiivinen, tämä tarkoittaa, että infektiota ei ole;
• positiivinen - se on.

Tartunnan tunnistaminen voi tapahtua myös ilman taudin oireita henkilöllä. Tämä on infektion alkuvaihe. Joskus voit saada väärän myönteisen vastauksen (kielteisen ja positiivisen tuloksen partaalla). Tässä tapauksessa analyysi on toistettava. Erityistä huomiota tulee kiinnittää sen varmistamiseen, että materiaali on kerätty täysin kaikkien vaatimusten mukaisesti.

PCR-analyysin määräajat

Käytännössä tutkimuksen tulos voidaan saada 2 päivässä. Joskus se voidaan tehdä nopeammin - toimituspäivänä.

Toimenpiteen hinta

PCR:n hinta määräytyy sen mukaan, mikä infektio testataan. Se riippuu myös testausmenetelmästä. Analyysin keskihinta on 200 - 850 ruplaa. Hinta sisältää myös maksun materiaalin keräämisestä - noin 400 ruplaa.

PCR-testauksen arvioidut hinnat.

Usein lääketieteelliset laitokset tarjoavat analysoida useita infektioita samanaikaisesti oikean tunnistamiseksi. Tällainen tutkimus maksaa enemmän, mutta se eliminoi lisätutkimusten tarpeen, mikä säästää potilaan aikaa.

Video "Polymeraasiketjureaktio"

Video kertoo PCR-menetelmän olemuksesta ja sen eduista. Kuvattu SiberianMedicalLaboratory-kanavalla.

Polymeraasiketjureaktio (PCR)

PCR-menetelmän ydin. DNA-polymeraasi

Polymeraasiketjureaktio on molekyylibiologian kokeellinen menetelmä, jonka avulla voidaan saavuttaa merkittävä lisäys tiettyjen nukleiinihappofragmenttien pienissä pitoisuuksissa biologisessa materiaalissa. Tätä DNA-kopioiden määrän lisäämisprosessia kutsutaan vahvistusta. DNA-kopiointi PCR:n aikana suoritetaan erityisellä entsyymillä - polymeraasi. DNA-polymeraasi (kuvio 3) on entsyymi, joka osallistuu DNA:n replikaatioon (DNA:n monistumiseen elävissä organismeissa). Tämän luokan entsyymit katalysoivat deoksiribonukleotidien polymeroitumista pitkin DNA:n nukleotidiketjua, jota entsyymi "lukee" ja käyttää templaattina. Uuden nukleotidin tyyppi määräytyy komplementaarisuuden periaatteen mukaan templaatin kanssa, josta lukeminen suoritetaan.

DNA-polymeraasi lisää vapaita nukleotideja kootun ketjun 3 "päähän. Tämä johtaa ketjun pidentymiseen 5"-3 suunnassa. Mikään tunnetuista DNA-polymeraaseista ei pysty luomaan ketjua "tyhjästä": ne ovat pystyy vain lisäämään nukleotideja jo olemassa olevaan 3"-hydroksyyliryhmään. Tästä syystä DNA-polymeraasi tarvitsee pohjamaali- lyhyt sekvenssi nukleotideja (yleensä 20-25), komplementaarinen tutkittavan geenin loppuosille - johon hän voisi lisätä ensimmäisen nukleotidin. Alukkeet koostuvat aina DNA- ja RNA-emäksistä, joista kaksi ensimmäistä emästä ovat aina RNA-emäksiä. Alukkeet syntetisoivat toinen entsyymi - primase. Toinen entsyymi on helicase- välttämätön DNA:n kaksoiskierteen purkamiseksi yksijuosteisen rakenteen muodostamiseksi, joka varmistaa molempien juosteiden replikaation DNA:n puolikonservatiivisen replikaation mallin mukaisesti.

Joillakin DNA-polymeraaseilla on myös kyky korjata virheitä vasta kootussa DNA-juosteessa. Jos havaitaan väärä nukleotidipari, DNA-polymeraasi rullaa yhden askeleen taaksepäin, poistaa väärän nukleotidin ketjusta ja lisää sitten oikean nukleotidin tilalle, minkä jälkeen replikaatio jatkuu normaalisti.

PCR:n suorittaminen

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on DNA:n monistusmenetelmä, jolla voidaan eristää ja monistaa tietty DNA-sekvenssi miljardeja kertoja muutamassa tunnissa. Mahdollisuus saada valtava määrä kopioita yhdestä tiukasti määritellystä genomin alueesta yksinkertaistaa huomattavasti olemassa olevan DNA-näytteen tutkimista.

Jotta polymeraasiketjureaktio tapahtuisi, useiden ehtojen on täytyttävä. PCR:ää varten tarvitaan yksinkertaisimmassa tapauksessa seuraavat komponentit:

DNA-templaatti, joka sisältää monistettavan DNA-osan.

Kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia halutun fragmentin päille. (Keinotekoisesti syntetisoitu oligonukleotidipari, yleensä kooltaan 15-30 bp, identtinen kohde-DNA:n vastaavien alueiden kanssa. Niillä on keskeinen rooli monistusreaktiotuotteiden muodostumisessa. Oikein valitut alukkeet varmistavat testin spesifisyyden ja herkkyyden järjestelmä.)

Lämpökestävä DNA-polymeraasi. PCR:ssä käytetyn polymeraasin tulee pysyä aktiivisena korkeassa lämpötilassa pitkään, siksi käytetään termofiileistä eristettyjä entsyymejä - Thermus aquaticus (Taq-polymeraasi) ja muita.

Deoksinukleotiditrifosfaatit (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polymeraasin toimintaan tarvittavat Mg 2+ -ionit.

Puskuriliuos, joka tarjoaa tarvittavat reaktioolosuhteet - pH, liuoksen ionivahvuus. Sisältää suoloja, seerumialbumiinia.

Reaktioseoksen haihtumisen välttämiseksi koeputkeen lisätään korkealla kiehuvaa öljyä, kuten vaseliinia. Jos käytetään lämmitetyllä kannella varustettua laitetta, sitä ei vaadita.

Pyrofosfataasin lisääminen voi lisätä PCR-reaktion saantoa. Tämä entsyymi katalysoi pyrofosfaatin hydrolyysiä, joka on sivutuote nukleotiditrifosfaattien lisäämisestä kasvavaan DNA-juosteeseen, ortofosfaatiksi. Pyrofosfaatti voi estää PCR-reaktion.

Alkuperäisen DNA:n kopioiden määrän moninkertaistamiseksi tarvitaan syklinen reaktio. Yleensä jokainen peräkkäin toistuva PCR-sykli koostuu kolmesta vaiheesta:

1. DNA:n denaturaatio tai "sulatus". Kaksijuosteinen DNA-templaatti kuumennetaan 94 - 96 °C:seen (tai 98 °C:seen, jos käytetään erityisen lämpöstabiilia polymeraasia) 0,5 - 2 minuutiksi, jotta DNA-säikeet voivat erottua. Tätä vaihetta kutsutaan denaturaatioksi, koska vetysidokset kahden DNA-juosteen välillä katkeavat. Joskus ennen ensimmäistä sykliä (ennen polymeraasin lisäämistä) reaktioseosta esilämmitetään 2–5 minuuttia templaatin ja alukkeiden denaturoimiseksi kokonaan. Tätä lähestymistapaa kutsutaan kuuma käynnistys, sen avulla voidaan vähentää epäspesifisten reaktiotuotteiden määrää.

2. Annealing - alukkeiden sitoutuminen templaatti-DNA:han. Kun säikeet ovat eronneet, lämpötilaa lasketaan hitaasti, jotta alukkeet voivat sitoutua yksisäikeiseen mallineeseen. Hehkutuslämpötila riippuu pohjamaalien koostumuksesta ja valitaan yleensä 50–65°C:een. Vaiheaika - 20 - 60 sekuntia. Virheellinen pariutuslämpötilan valinta johtaa joko alukkeiden huonoon sitoutumiseen templaattiin (korotetussa lämpötilassa) tai sitoutumiseen väärään paikkaan ja epäspesifisten tuotteiden ilmaantuvuuteen (alhaisessa lämpötilassa).

3. Synteesi (ketjun venyminen). DNA-polymeraasi replikoi templaattijuosteen käyttämällä aluketta "siemenenä". Polymeraasi aloittaa toisen juosteen synteesin alukkeen 3" päästä, joka on sitoutunut templaattiin ja liikkuu templaattia pitkin. Pidentymislämpötila riippuu polymeraasista. Yleisesti käytetyt Taq- ja Pfu-polymeraasit ovat aktiivisimpia 72 °C:ssa °C monistettavan fragmentin pituus Tyypillisesti venymäajaksi otetaan yksi minuutti jokaista tuhatta emäsparia kohden Kun kaikki syklit on suoritettu loppuun, suoritetaan usein lisävaihe lopullinen venymä täydentääksesi kaikki yksijuosteiset fragmentit. Tämä vaihe kestää 7-10 minuuttia.

Sen jälkeen denaturaatio-, lämpökäsittely- ja venymävaiheet toistetaan monta kertaa (30 tai enemmän). Jokaisessa syklissä DNA-fragmentin syntetisoitujen kopioiden määrä kaksinkertaistuu.

Kaikki reaktiot suoritetaan koeputkissa, jotka on upotettu termostaattiin. Lämpötilatilan muuttaminen ja sen ylläpito tapahtuu automaattisesti.

Ymmärtääksemme tarkasti, kuinka tietyn DNA-segmentin monistuminen tapahtuu PCR:n aikana, on välttämätöntä ymmärtää selvästi kaikkien alukkeiden ja niiden komplementaaristen sekvenssien sijainti monistuvissa ketjuissa jokaisella kierroksella. Ensimmäisellä kierroksella jokainen äskettäin syntetisoitu ketju on paljon pidempi kuin etäisyys sen alukkeen 3"-hydroksyyliryhmästä toiselle alukkeelle komplementaarisen sekvenssin terminaaliseen nukleotidiin. Tällaisia ​​ketjuja kutsutaan "pitkiksi templaatteiksi". niiden päällä tapahtuu lisäsynteesi.

Toisella kierroksella kaksijuosteinen DNA, joka koostuu samankaltaisista ja äskettäin syntetisoiduista (pitkä templaatti) juosteista, denaturoidaan ja sitten paritetaan alukkeilla. Tämän kierroksen synteesin aikana syntetisoidaan uudelleen "pitkiä templaatteja" sekä useita juosteita, joiden toisessa päässä on aluke ja toisessa toisessa alukkeessa komplementaarinen sekvenssi ("lyhyet templaatit"). Kolmannen kierroksen aikana kaikki aiemmin muodostuneet heterodupleksit denaturoidaan ja paritetaan alukkeilla samanaikaisesti ja replikoidaan sitten. Seuraavilla kierroksilla "lyhyitä matriiseja" on enemmän ja enemmän, ja 30. kierroksella niiden lukumäärä on jo 10 6 kertaa suurempi kuin alkuketjujen tai "pitkien matriisien" lukumäärä.

Spesifisen reaktiotuotteen määrä (rajoitettuna alukkeilla) kasvaa teoreettisesti suhteellisesti arvoon 2 n, missä n on reaktiosyklien lukumäärä. Itse asiassa kunkin syklin tehokkuus voi olla alle 100%, joten todellisuudessa:

jossa P on tuotteen määrä, E on syklin keskimääräinen hyötysuhde.

Myös "pitkien" DNA-kopioiden määrä kasvaa, mutta lineaarisesti, joten tietty fragmentti hallitsee reaktiotuotteita. Tarvittavan tuotteen kasvua rajoittavat eksponentiaalisesti reagenssien määrä, inhibiittorien läsnäolo ja sivutuotteiden muodostuminen.

PCR on erittäin herkkä menetelmä, joten jos koenäytteessä on merkityksetönkin määrä DNA:ta, joka on päässyt vahingossa reaktioseoksesta toiseen, voidaan saada vääriä positiivisia tuloksia. Tämän vuoksi on välttämätöntä valvoa huolellisesti kaikkia PCR:ssä käytettyjä liuoksia ja välineitä.

Pohjamaalin valinnan perusperiaatteet.

PCR-testijärjestelmää luotaessa yksi tärkeimmistä tehtävistä on oikea alukkeiden valinta, joiden on täytettävä useita kriteerejä:

1. Pohjusteiden on oltava erityisiä. Erityistä huomiota kiinnitetään alukkeiden 3"-päihin, koska juuri niistä Taq-polymeraasi alkaa täydentää DNA-ketjua. Jos niiden spesifisyys on riittämätön, on todennäköistä, että koeputkessa tapahtuu ei-toivottuja prosesseja. reaktioseos, nimittäin epäspesifisen DNA:n (lyhyiden tai pitkien fragmenttien) synteesi.Se näkyy elektroforeesissa raskaiden tai kevyiden lisävyöhykkeiden muodossa. Tämä vaikeuttaa reaktion tulosten arviointia, koska se on spesifinen monistustuote on helppo sekoittaa syntetisoituun vieraaseen DNA:han.Osa alukkeista ja dNTP:istä kuluu epäspesifisen DNA:n synteesiin, mikä johtaa merkittävään tuntoherkkyyden menetykseen.

2. Alukkeet eivät saa muodostaa dimeerejä ja silmukoita, ts. stabiileja kaksoissäikeitä ei saa muodostaa hehkuttamalla alukkeet toisiinsa tai toisiinsa.