Molekyylidiagnostiikan tarkkuus PCR-menetelmällä. Polymeraasiketjureaktio (PCR-diagnostiikka)

Polymeraasimenetelmä ketjureaktio, tai PCR:ää, käytetään useimmissa laboratoriodiagnostiikassa tarttuvat taudit. Sen avulla voit havaita tutkittavassa materiaalissa olevien mikro-organismien geneettisen materiaalin ja siten tunnistaa ne.

Mikä se on

Menetelmä kehitettiin vuonna 1983, ja vuonna 1993 sen kirjoittaja Mullis sai Nobel-palkinnon.

Menetelmän perusteet

Jokaisella mikro-organismityypillä, kasvella tai eläimellä on ainutlaatuinen sarja kromosomeja. Ne muodostuvat DNA - deoksiribonukleiinihaposta. Pieniä DNA-fragmentteja kutsutaan nukleotideiksi, ja niiden spesifinen sekvenssi muodostaa geenin. Jokainen geeni koodaa yhden proteiinin synteesiä, esimerkiksi kollageenin, albumiinin ja kaikkien muiden. Nukleotidisekvenssi on ainutlaatuinen. Jokaisella elävien organismien lajilla on yhteisiä DNA-osia, jotka vastaavat yhtenäisyydestä kyseisen lajin sisällä.

Tutkimusaineistoon sisältyvien useiden sadan mikrobien DNA-analyysi ei paljasta lajikuvioita. Merkittävien geneettisten komponenttien määrää on moninkertaistettava, mikä mahdollistaa niiden tunnistamisen. Tämä ongelma ratkaistaan ​​PCR-menetelmällä.

Tutkimus liittyy molekyylibiologian alaan. DNA-polymeraasia ja vapaita nukleotideja lisätään mikrobien DNA:han. Polymeraasi on entsyymi, joka varmistaa useita kopioita halutusta alueesta saatavilla olevista nukleotideistä. Prosessi aloitetaan alukkeilla - lyhyillä ribosäikeillä nukleiinihappo(RNA), joka kiinnittyy halutun geenin alkuun.

Analyysiprosessi koostuu useista vaiheista, joista jokainen vaatii tietyn ajan ja lämpötilajärjestelmä. Muutaman tunnin sisällä tarvittava määrä analyysimateriaalia saadaan tuhannesosasta grammaa bakteeri-DNA:ta. Nykyaikaiset laitteet mahdollistavat jopa yhden solun, esimerkiksi siittiön, DNA:n kopioinnin toistuvasti.

Tutkimuksen edistyminen

Analyysivaiheet:

• biologisen materiaalin (veri, virtsa, emättimen eritteet, sylki jne.) ottaminen potilaalta ja toimittaminen laboratorioon;
• kahden DNA-juosteen erottaminen, joiden yhteenkutoutuminen muodostaa kromosomin, ja niiden puhdistaminen vieraista epäpuhtauksista;
• DNA-juosteen halutun osan kaksinkertaistuminen, minkä seurauksena sen määrä kasvaa geometrinen eteneminen;
• tuloksena olevan materiaalin käsittely liuoksilla, jotka aiheuttavat tuloksena olevien DNA-fragmenttien spesifistä luminesenssia; tätä värjäystä käytetään tunnistamaan, mikä bakteeri tai virus oli lähteessä; Elektroforeesia käytetään DNA-fraktioiden erottamiseen.

Analyysin kesto on 4-5 tuntia.

PCR-menetelmän edut

Polymeraasiketjureaktiolla on seuraavat edut perinteisiin tartunnanaiheuttajien tunnistamismenetelmiin verrattuna:

• mikro-organismin geenien suora määrittäminen, toisin kuin sen vasta-aineiden havaitseminen monissa muissa tunnistusmenetelmissä;
• spesifisyys, toisin sanoen tietyn patogeenin tyypin määrittäminen;
• herkkyys: jopa yksi mikro-organismin solu riittää diagnoosiin; yleensä vaadittu patogeenin määrä on 10 kertaa pienempi kuin muissa menetelmissä;
• biomateriaalin monipuolisuus - ei tutkita vain verta, vaan myös tiheitä kudossoluja, epiteelin naarmuja, limakalvon eritteitä ja kaikkia muita ympäristöjä, joissa mikrobi voi olla läsnä;
• tulosten saamisen nopeus on useita kertoja suurempi kuin muita menetelmiä käytettäessä;
• kyky tunnistaa kroonisia, hitaita ja piileviä infektioita;
• potilaalta otetun materiaalin desinfiointi ja laboratoriohenkilöstön kontaminaation estäminen;
• tutkimusprosessin täysi automatisointi.

Analyysin haitat

PCR:n haitat liittyvät pääasiassa sen tekniseen monimutkaisuuteen:

• on tarpeen valita oikeat RNA-sekvenssit - alukkeet ja valmistaa myös nukleotidiseos DNA-synteesiä varten;
• menetelmä on erittäin herkkä, joten jos näytteessä on erityyppisiä mikrobeja, se voi antaa virheellisiä tuloksia;
• analysoitu materiaali on puhdistettava huolellisesti ihmisen proteiinien ja lääkkeiden epäpuhtauksista, koska ne vähentävät diagnoosin tarkkuutta;
• Tulosten kontrollivertailu näytteisiin, joiden tiedetään sisältävän tai ei sisällä mikrobimateriaalia, sekä ilman DNA:ta ollenkaan, on tarpeen virheiden ja kontaminaation määrittämiseksi.

Väärin negatiiviset PCR-tulokset johtuvat analyysitekniikan rikkomisesta ja muutoksista reaktion minkä tahansa komponentin geneettisessä sekvenssissä. Vääriä positiivisia tietoja esiintyy myös silloin, kun alukkeiden ja muiden käytettyjen reagenssien nukleotidit osuvat vahingossa yhteen mikro-organismin geenin kanssa.

Mikro-organismin eristäminen ei aina osoita, että se oli taudin syy. Ihmisen DNA:n analysoinnissa on toinenkin ongelma: geneettinen perusta Suurin osa sairauksista on edelleen tuntemattomia, minkä vuoksi ei-tarttuvien patologioiden diagnosointi mikrobiologisella tasolla on mahdotonta. Tämä on suunta lääketieteellinen genetiikka kehittyy erittäin aktiivisesti.

Indikaatioita PCR-testaukseen

Tätä analyysiä käytetään seuraavissa tilanteissa:

• tarve havaita ja tunnistaa virukset, bakteerit ja alkueläimet kaikissa tartuntataudeissa, kun vaaditaan diagnostista tarkkuutta;
• yksilön tunnistaminen vertaamalla tunnettua alkuperää olevaan geneettiseen materiaaliin;
• hienoneulatekniikalla saatujen kudosten analysointi, joita on erittäin vaikea tutkia muilla menetelmillä;
• leukemian ja pahanlaatuisten kasvainten diagnosointi;
• kokeiden suorittaminen alkion kantasolujen siirtämiseksi eläimiin (tällaisten solujen käyttö ihmisillä on kielletty), sekä laboratoriohiirten jalostuslinjoja, joilla on ennalta määrätty geneettinen sairaus.

PCR-reaktion käyttömahdollisuudet ja sen muunnelmat lääketieteessä ja biologiassa valloittavat mielikuvituksen - uusien lääkkeiden testaamisesta geenitasolla siirtogeenisten organismien luomiseen, joilla on tietyt ominaisuudet. Tämänsuuntaista työtä tehdään maailman suurimmissa laboratorioissa, mikä auttaa parantamaan PCR-menetelmää sovelletulla tasolla ihmisen tartuntatautien diagnosoinnissa.

Lääketieteessä PCR-menetelmää käytetään yleensä seuraavien sairauksien diagnosoimiseen ja hoidon tehokkuuden arvioimiseen:

• solunsisäiset infektiot, esimerkiksi tai;
• seksuaalisen kontaktin kautta leviävät sairaudet;
• Helicobacter pylori -infektio ja monet muut.

Valmistautuminen tutkimukseen

3 päivää ennen testiä sinun on lopetettava alkoholin juonti. Jotkut lääkkeet, kuten antibiootit, lopetetaan lääkärin määräämällä tavalla.

Säännöt valmistautumisesta diagnosoitaessa sukupuoliteitse tarttuvia infektioita:

• 2 päivää ennen testiä lopeta seksuaalinen kanssakäyminen;
• 2 tuntia ennen testiä älä virtsaa;
• älä huuhtele edellisenä iltana ja aamulla; pese vain lämmintä vettä ei pesuaineita;
• älä ota PCR-testejä aikana ja 4 päivää sen jälkeen (naisilla).

Yleiset valmistelusäännöt:

• 2 päivää etukäteen pois intensiivi fyysinen harjoitus, Urheilu;
• tutkimuspäivän aamulla älä tupakoi tai syö ruokaa;
• Jos materiaali otetaan suusta ja nenänielusta, älä pese hampaitasi aamulla.

Tekemällä näitä yksinkertaiset säännöt Tämän tarkan, mutta kalliin diagnoosimenetelmän luotettavuus riippuu. Tuloksen riippumaton tulkinta ei anna tarvittavaa tietoa taudista ja sen hoidosta. Siksi PCR-testitietojen saatuasi sinun on otettava yhteys lääkäriin.

Mihin lääkäriin minun pitäisi ottaa yhteyttä?

Jos epäillään sukupuolitautia, gynekologi, urologi, andrologi tai venereologi lähettää sinut PCR:ään. Hepatiitin ja HIV-infektion tutkimuksen määrää infektiotautien asiantuntija ja tuberkuloosiin - ftisiatri. PCR:ää käyttävät käytännössä monien erikoisalojen lääkärit, esimerkiksi onkologit, hematologit, gastroenterologit ja geneetikot.

Ihmiset alkoivat puhua PCR-analyysistä ensimmäisen kerran vuonna 1983. Tämän tekniikan kehitti Kary Mullis ja hänen laboratorionsa jäsenet. Siitä lähtien tutkimuksen suosio on kasvanut tasaisesti, koska sillä on huomattava määrä etuja muihin menetelmiin verrattuna.

Nykyään PCR-diagnostiikka on vertailukohta tai standardi infektioiden ja patogeenien, erityisesti oireettoman, tunnistamisessa. Ensinnäkin tämä on prekliinistä diagnoosia.

Analyysin suorittaminen PCR-koneella

PCR-analyysin ydin on, että tietyntyyppiselle patogeenille ominaiset nukleiinihapposekvenssit (DNA tai RNA) kloonataan (lisätään monta kertaa) koeputkessa.

Lyhenne PCR tarkoittaa polymeraasiketjureaktiota.

Koti erottava piirre tästä menetelmästä on amplifikaatio, ts. luoda valtava määrä kopioita vaaditusta geenistä tai sen fragmentista. Kaikki tämä tuotetaan kehon ulkopuolella, ts. in vitro.

Joten jos suoritetaan 20 PCR-sykliä, saadaan noin miljoona kopiota tai enemmän. Tämä mahdollistaa tartunnan havaitsemisen silloinkin, kun sen määrä on lähdemateriaalissa merkityksetön, kun muut analyysimenetelmät ovat tehottomia. Tämä määrittää tämän menetelmän suuren herkkyyden.

Yksinkertaisesti sanottuna voit vetää seuraavan analogian: et huomaa yhtä pientä hiekkajyvää lattialla, mutta kun hiekanjyvien määrä on kasvatettu miljoona kertaa (PCR), hiekkakasa on jo selvästi näkyvissä. .

Infektioiden testaamisen PCR-menetelmällä tärkeimmät edut ovat:

• korkein herkkyys ja spesifisyys verrattuna muihin tartunta-aineiden havaitsemiseen käytettyihin menetelmiin;
• kyky havaita mikro-organismeja erilaisissa biologisissa materiaaleissa (veri, virtsa, emättimen erite, sylki jne.);
• kyky tunnistaa samanaikaisesti useita aiheuttavia mikro-organismeja, jos sellaisia ​​on. Vertailun vuoksi bakteriologisten menetelmien käyttö ei tarjoa tällaista mahdollisuutta, koska hakemus vaaditaan erilaisia ​​ympäristöjä erilaisten patogeenisten mikrobien kasvattamiseen;
• mahdollisuus kuljettaa biologista materiaalia, koska Patogeenin tunnistamiseksi ei ole välttämätöntä pitää sitä hengissä;
• analyysin nopeus;
• etiologisen diagnoosin tarkkuus;
• mahdollisuus patogeenien kvantitatiiviseen määritykseen - erityisen tärkeä opportunistisille mikrobeille, jotka vasta saavutettuaan tietyn pitoisuuden voivat aiheuttaa sairauksia;
• kyky hallita tarttuvan prosessin kulkua hoidon aikana.

PCR-analyysi infektioiden varalta

Tällä hetkellä suurin osa sukupuoliteitse tarttuvista (ja muista) tartuntataudeista määritetään polymeraasiketjureaktiomenetelmällä. Diagnostiikka on yleistynyt sen korkean herkkyyden ja spesifisyyden vuoksi.

Klamydian PCR-analyysi on erityisen suosittu.

Tämä johtuu siitä, että nämä mikro-organismit elävät solunsisäisesti, mikä aiheuttaa tiettyjä vaikeuksia niiden havaitsemisessa.

PCR-diagnostiikan avulla voidaan havaita pienikin määrä klamydiaa, joka ei pääsääntöisesti vielä johda kliinisten oireiden ilmaantumiseen. Jopa vain 2 nukleiinihappomolekyylin läsnäolo testimateriaalissa mahdollistaa aiheuttavan infektion tunnistamisen.

Ja tämä on avain onnistuneeseen hoitoon, joka alkaa prekliinisestä vaiheesta.

Infektiot määritetään myös:

• virushepatiitti;
• tuberkuloosi;
• puutiaisaivotulehdus;
• erilaiset sukupuolitaudit jne.

PCR-diagnostiikan avulla voit ratkaista useita muita tärkeitä ongelmia:

• hoidon seuranta ja sen tehokkuuden arviointi;
• "viruskuorman" määrittäminen, jonka perusteella valitaan yksilöllinen lääkeannos;
• farmakologisesti resistenttien (lääkkeille epäherkkien) mikro-organismikantojen tunnistaminen.

Testiin valmistautuminen

Testiin ei tarvitse erikseen valmistautua, vaan se suoritetaan PCR-menetelmällä. On kuitenkin erittäin tärkeää, että asiantuntija kerää materiaalin kaikkien vaatimusten mukaisesti tarvittavat ehdot steriiliys.

Joten esimerkiksi veren ottamiseen tulisi käyttää erityisiä tyhjiöjärjestelmiä, sukuelinten eritteiden ottamiseen erityisiä putkia jne.

Joissakin tapauksissa materiaali on kuljetettava laboratorioon. Jotta tämä tehdään oikein, säiliö on suljettava hermeettisesti biologisella materiaalilla. Tämä estää muiden ulkoisessa ympäristössä elävien mikro-organismien tunkeutumisen.

PCR-analyysin tuloksissa voi olla kaksi vaihtoehtoa:

• positiivinen – patogeeni havaittu;
• negatiivinen – taudinaiheuttajaa ei ole tunnistettu.

Sinun pitäisi tietää, että jopa kliinisten oireiden puuttuessa voidaan saada positiivinen tulos.

Tässä tapauksessa on välttämätöntä keskittyä polymeraasireaktiotietoihin, koska sen avulla voit tunnistaa taudin prekliinisessä vaiheessa.

Joskus voidaan saada kyseenalainen vastaus, kun havaittujen kopioiden määrä vastaa normaalin ylärajaa. Taudin syyn selvittämiseksi analyysi tulee toistaa kiinnittäen erityistä huomiota biologisen materiaalin keruuolosuhteisiin.

Kuinka tarkkaa PCR-diagnostiikka on?

PCR-diagnostiikan tärkeimmät edut voidaan muotoilla useiden teesien muodossa:

• mahdollisuus saada valtava määrä kopioita patogeenisista mikro-organismeista;
• suuri kopioiden määrä on avain onnistuneeseen sekvensointiin (tunnistukseen).

Tämä varmistaa PCR-analyysin suuren tarkkuuden solunsisäisten patogeenien ja hitaasti kasvavien mikro-organismien havaitsemiseksi.

Siksi menetelmä on erityisen informatiivinen tuberkuloosimykobakteerien ja muiden vastaavien tartunnanaiheuttajien tunnistamiseksi. Sillä on suurin tarkkuus, eikä sen tarvitse tarkistaa saatuja tuloksia uudelleen (paitsi satunnaisissa tapauksissa).

Luotettavimpien tulosten saamiseksi on täytettävä kaksi perusehtoa, jotka estävät eksogeenisen (ulkoisen) infektion:

• oikea materiaalin valinta;
• oikea kuljetus.

Sivusto tarjoaa taustatieto vain tiedoksi. Sairauksien diagnosointi ja hoito on suoritettava asiantuntijan valvonnassa. Kaikilla lääkkeillä on vasta-aiheita. Asiantuntijan konsultointi on tarpeen!

Millä lääketieteen aloilla tätä menetelmää käytetään?

• Eristä ja kloonaa geenejä.
• Diagnosoi geneettiset ja tartuntataudit.
• Selvitä isyys. Lapsi perii osan geneettisistä ominaisuuksistaan ​​biologisilta vanhemmiltaan, mutta hänellä on oma ainutlaatuinen geneettinen identiteettinsä. Joidenkin vanhempien geenien kanssa identtisten geenien läsnäolo antaa meille mahdollisuuden puhua suhteen luomisesta.

Rikospaikalla oikeuslääketieteen tutkijat keräävät näytteitä geneettisestä materiaalista. Näitä ovat: hiukset, sylki, veri. Tämän jälkeen DNA voidaan monistaa polymeraasireaktiotekniikan avulla ja verrata otetun näytteen identiteettiä epäillyn geneettiseen materiaaliin.

Polymeraasiketjureaktiota käytetään tehokkaasti lääketieteessä:

• Pulmonologisessa käytännössä - keuhkokuumeen, tuberkuloosin bakteeri- ja virustyyppien erottamiseksi.
• Gynekologisessa ja urologisessa käytännössä - ureaplasmoosin, klamydian, mykoplasma-infektion, gardnerelloosin, herpesin, gonorrhean määrittämiseen.
• Gastroenterologisessa käytännössä.
• Hematologiassa - onkovirusten ja sytomegalovirusinfektion määrittämiseen.
• Tartuntatautien, kuten virushepatiitti, kurkkumätä, salmonelloosi, nopeassa diagnosoinnissa.

Tällä hetkellä yleisin tätä menetelmää tartuntatautien diagnosoinnissa ( virusperäinen hepatiitti, HIV, sukupuolitaudit, tuberkuloosi, puutiaisaivotulehdus).

Mitä tapahtuu reaktion aikana?

Polymeraasireaktio mahdollistaa infektion havaitsemisen, vaikka biologista materiaalia sisältävä näyte sisältäisi vain yhden tai useamman taudinaiheuttajan DNA-molekyylin.

Reaktion aikana tapahtuu DNA-polymeraasientsyymin ansiosta kaksinkertaistuminen ( replikointi) DNA:n osa. Itse deoksiribonukleiinihappo ( lyhennettynä DNA) on meille tärkeä, koska se varmistaa geneettisen tiedon tallentamisen ja siirron tytärsoluihin. DNA on muodoltaan kierre, joka koostuu toistuvista lohkoista. Nämä lohkot muodostavat nukleotideja, jotka ovat pienin hiukkanen DNA. Nukleotidit muodostuvat aminohapoista.

DNA-osien replikaatioprosessi tapahtuu toistuvien syklien aikana. Jokaisessa tällaisessa syklissä ei kopioida ja kaksinkertaistu vain alkuperäinen DNA-fragmentti, vaan myös ne fragmentit, jotka kaksinkertaistettiin jo edellisessä monistussyklissä. Kaikki tämä muistuttaa geometrisen etenemisen prosessia.

Olemassa:

• Luonnollinen vahvistus ( eli DNA:n kopiointi- ja lisääntymisprosessi), joka esiintyy kehossamme ja on deterministinen, ennalta määrätty prosessi.
• Keinotekoinen vahvistus, joka tapahtuu polymeraasiketjureaktion vuoksi. Tässä tapauksessa kopiointiprosessia ohjataan ja se mahdollistaa jopa lyhyiden nukleiinihapon osien monistamisen.

Kolmenkymmenen-neljänkymmenen syklin jälkeen fragmenttien määrä saavuttaa useita miljardeja.

Vahvistusta varten in vitro (in vitro) on välttämätöntä, että tietty vieras DNA-fragmentti ( eli DNA ei ole potilaan, vaan taudinaiheuttajan DNA). Jos luotu liuos ei sisällä tiettyä fragmenttia, ketjureaktio polymeraasin vaikutuksesta ei etene. Tämä selittää PCR:n korkean spesifisyyden.

PCR-diagnostiikan vaiheet

6. Suorittamalla elektroforeesi tulokset summataan ja tuplaustulokset lasketaan.

Mitkä ovat tämän diagnoosin edut?

• Monipuolisuus: Mikä tahansa nukleiinihapponäyte sopii tähän menetelmään.
• Korkea spesifisyys: patogeenilla on ainutlaatuisia sille spesifisiä DNA-ketjusekvenssejä. Siksi PCR:n tulokset ovat luotettavia, on mahdotonta sekoittaa yhden patogeenin geeniä toisen patogeenin geeniin.
• Herkkyys jopa yhden patogeenimolekyylin läsnäololle.

• Tutkimukseen tarvitaan pieni määrä materiaalia. Jopa pisara verta riittää. Mahdollisuus saada tuloksia minimaalisella näytemäärällä on erittäin tärkeä lasten, neonatologisten, neurologisten tutkimusten sekä oikeuslääketieteen käytännössä.
• Kyky määrittää laiska, krooninen infektio, ei vain akuutti.
• Monia patogeenisiä viljelmiä on erittäin vaikea viljellä in vitro muilla menetelmillä, ja polymeraasireaktio mahdollistaa sadon lisäämisen vaaditussa määrässä.

Mitä haittoja tällä diagnoosilla on?

• Jos PCR:ään tarkoitettu materiaali sisältää paitsi elävän, myös kuolleen patogeenin DNA:ta, tapahtuu molempien DNA:n monistuminen. Näin ollen diagnoosin jälkeen määrätty hoito ei välttämättä ole täysin oikea. Jonkin ajan kuluttua on parempi seurata hoidon tehokkuutta.
• Lisääntynyttä herkkyyttä mikro-organismien läsnäololle voidaan myös pitää jollain tavalla haittana. Loppujen lopuksi ihmiskeho sisältää normaalisti opportunistista mikroflooraa, eli nämä ovat mikro-organismeja, jotka elävät suolistossa, mahassa ja muissa sisäelimet. Nämä mikro-organismit voivat aiheuttaa vahinkoa ihmisille vain tietyissä epäsuotuisissa olosuhteissa - noudattamatta jättäminen hygieniavaatimukset, saastunutta juomavettä jne. PCR-tekniikka monistaa jopa näiden mikro-organismien DNA:ta, vaikka ne eivät johda patologiaan.
• Eri testijärjestelmien PCR voi näyttää tuloksia, jotka eroavat toisistaan. Tästä tekniikasta on monia muunnelmia: " sisäkkäisiä», « epäsymmetrinen», « ylösalaisin», « määrällinen» PCR ja muut.

Nykyaikaiset korkean teknologian menetelmät laboratoriotutkimus avulla voimme tunnistaa sairaudet varhaisessa vaiheessa. Tartuntataudit kehittyvät ja kehittyvät, niitä tulee yhä enemmän ja niitä on yhä vaikeampi tunnistaa. PCR-menetelmää (polymeraasiketjureaktio) käyttävä diagnostiikka on yksi uusimmista ja tarkimmista. Sen kehittämisestä tiedemies Kary Mullis sai Nobel-palkinnon.

Polymeraasiketjureaktio– molekyyligeneettisen diagnostiikan menetelmä, joka mahdollistaa erityyppisten infektio- ja perinnöllisten patologioiden löytämisen ihmisistä sekä akuuteissa että krooninen muoto, ja kauan ennen kuin patologia alkaa ilmetä. Useimmat lääkärit kohtaavat tämän analyysin joka päivä, eivätkä voi enää kuvitella, kuinka ilman sitä on mahdollista tehdä oikea diagnoosi ja taudin vaihe.

PCR-diagnostiikan ydin

PCR-analyysissä käytetään molekyylibiologian periaatteita. Se käyttää erityisiä entsyymejä, jotka kopioivat toistuvasti RNA- ja DNA-fragmentteja, sekä mikro-organismeja, jotka aiheuttavat sairauksia ja joita löytyy ihmisen biologisista materiaaleista. Kopiointi tapahtuu useissa vaiheissa, joten muodostuu ketjureaktio. Tämän jälkeen laboratorioasiantuntijat vertaavat saatuja tietoja yhteiseen tietokantaan ja tunnistavat taudin aiheuttajat ja niiden pitoisuuden. Diagnoosi tehdään v erityinen laite, joka jäähdyttää ja lämmittää koeputkea biomateriaalilla ja jota kutsutaan lämpösykliksi. Lämpötilajärjestelmän noudattaminen vaikuttaa analyysitulosten todenperäisyyteen.

Mikro-organismin DNA-fragmentteja voi sisältyä seuraaviin biologisiin materiaaleihin:

• biologiset nesteet;
• veri ja sen johdannaiset;
• epiteelisolujen kaapiminen tai sively;
• virtsa;
• yskös;
• lima ja muut biologiset eritteet;
• limakalvojen biopatiat Ruoansulatuskanava.

Missä PCR-diagnostiikkaa käytetään?

Mahdollisuudet infektiosairauksien diagnosointiin polymeraasiketjureaktion avulla ovat suuret, sillä voidaan tunnistaa monenlaisia ​​infektioita aiheuttavia viruksia, kuten:

Ei ole täydellinen lista sairaudet, jotka havaitaan PCR-analyysillä. Suurin osa näistä patologioista on aikainen vaihe ovat käytännössä huomaamattomia, mutta niiden vaikutuksen seuraukset kehoon ovat erittäin kielteisiä ja usein vaarallisia ihmisten terveydelle ja elämälle.

Raskaana oleville naisille määrätään PCR-testi sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden havaitsemiseksi, mikä lisää merkittävästi kohdunkaulan syövän riskiä ja vaikuttaa haitallisesti raskauden kulumiseen ja lapsen terveyteen. Siksi sukupuolitautien diagnosointi on erittäin tärkeää sikiön tartunnan ehkäisemiseksi patogeenisilla mikro-organismeilla.

Kaiken edellä olevan perusteella voimme päätellä, että laboratoriodiagnostiikka PCR-menetelmän käyttö auttaa lääkäriä tekemään tarkan diagnoosin ja määräämään tehokkaan hoidon jokaisessa yksittäistapauksessa.

Tämä on mielenkiintoista! Lääketieteen lisäksi PCR-menetelmää käytetään myös muilla aloilla, esimerkiksi oikeuslääketieteessä, kun on tarpeen tunnistaa rikospaikalta löydetyn biomateriaalin omistaja, ja joskus PCR-menetelmää käytetään isyyden määrittämiseen, kokeiden tekemiseen DNA-mutaatiot ja muut kokeet.

Menetelmän plussat ja miinukset

PCR-diagnostiikan edut ovat:

• testin korkea herkkyys mahdollistaa jopa yksittäisten patogeenin tekijöiden tunnistamisen, mikä mahdollistaa patologian tunnistamisen varhaisessa vaiheessa, kroonisissa ja piilevässä muodossa;
• menetelmän monipuolisuus mahdollistaa lähes minkä tahansa biomateriaalin käytön tutkimukseen syljestä ihosoluihin;
• suuri kattavuus - tutkimalla yhtä näytettä on mahdollista määrittää useiden eri patogeenien esiintyminen;
• tarkkuus - korkeatasoinen Tämän tutkimusmenetelmän avulla et anna vääriä indikaattoreita;
• nopeus - tulos on valmis keskimäärin viidessä tunnissa, eli potilas voi poimia johtopäätöksen seuraavana päivänä biomateriaalin lähettämisen jälkeen;
• suhteellisesti alhainen hinta– tämä diagnostinen menetelmä ei eroa hinnaltaan muista laboratoriokokeet veri;
• Tällä menetelmällä voidaan tehdä prekliinistä ja retrospektiivistä diagnostiikkaa. Ensimmäinen tunnistaa patogeeniset mikro-organismit jo ennen taudin puhkeamista, ja toinen suoritetaan patologian kärsimisen jälkeen, minkä avulla voit estää patologian kehittymisen ja parantaa sen ajoissa sekä määrittää taudin piilevän muodon. sairaus, joka ilmenee ilman ilmeisiä oireita.

Mutta täydellisiä diagnostisia menetelmiä ei ole, joten PCR:llä on myös haittoja:

• korkeat vaatimukset teknologisen prosessin noudattamiselle;
• korkeat vaatimukset laboratorioteknikon ammattitaidolle.

Neuvoja! On parempi suorittaa tällainen analyysi vain parhaissa ja ammattimaisimmissa laboratorioissa, joissa on otettu käyttöön tiukat laadunvalvontajärjestelmät.

Tulosten luotettavuuden vuoksi on tarpeen noudattaa analyysin alustavan valmistelun sääntöjä:

• kun luovutat sylkeä, sinun ei pidä syödä tai juoda lääkkeitä neljä tuntia ennen testiä; ennen toimenpidettä sinun on huuhdeltava suusi keitetyllä vedellä ja suoritettava sitten pieni ihohieronta eritteen vapauttamiseksi rauhasesta;
• Virtsa kerätään yleensä kotona. Ennen tätä on tarpeen pestä sukuelimet ja kerätä 50 ml ensimmäistä aamuvirtsaa erityiseen astiaan; ei ole suositeltavaa kerätä materiaalia kuukautisten aikana;
• Ennen siittiöiden luovuttamista mies ei saa olla sukupuoliyhteydessä kolmeen päivään, olla saunassa, kuumassa kylvyssä, alkoholittomassa tai mausteisessa ruuassa. Välittömästi ennen testiä on kielletty virtsata kolmen tunnin ajan;
• Urogenitaalinäytteen ottamiseksi on suositeltavaa, että et ole seksissä kolmeen päivään. Kaksi viikkoa ennen testiä antibakteeristen lääkkeiden käyttö on kielletty. Viikon ajaksi sinun on lopetettava intiimigeelien, voiteiden, emättimen peräpuikkojen ja douchingin käyttö. Kolme tuntia ennen biomateriaalin ottamista sinun on pidättäydyttävä käymästä wc: ssä.
• Veri luovutetaan aamulla tyhjään vatsaan.

Diagnostista materiaalia tulee kerätä olosuhteissa, jotka estävät sen kontaminoitumisen, koska tämä voi merkittävästi vaikuttaa PCR-tuloksen todenperäisyyteen.

Analyysikopio

Testi voi näyttää positiivisen tai negatiivisen tuloksen. Negatiivinen tarkoittaa, että kehossa ei ole epäiltyjä infektioita ja henkilö on terve. Positiivinen kertoo, että potilas on sairas ja tarvitsee hoitoa. Lääkärin on tulkittava ja ilmaistava kaikki indikaattorit. Sinun ei pitäisi olla järkyttynyt tai pelätä huonoja tuloksia, terapia määrätään niiden perusteella; tärkeintä ei ole viivyttää prosessia eikä itsehoitoa.

Piditkö artikkelistamme? Jaa ystävien kanssa sosiaalisessa mediassa. verkot tai arvioi tämä viesti:

(Ei vielä arvioita)

Olen yleislääkäri, yleislääkäri. Osaamiseeni kuuluu potilaiden varhaisdiagnoosit ja monien maha-suolikanavan, keuhkojen ja sairauksien hoito. hengitysteitä, maksa, munuaiset, sydän- ja virtsaelimet, ihosairaudet, aineenvaihduntahäiriöt jne. 15 vuoden kokemus yleislääkärinä Moskovan klinikoilla, joista 5 työskenteli yhdessä sairaalassa Pietarissa. Vastaan ​​mielelläni kysymyksiin lukijablogistani.

PCR on infektioiden diagnosointi, moderni ja erittäin tarkka tapa havaita erilaisia ​​tartuntatauteja. Miten se eroaa muista analyyseistä?

Tämä lyhenne tarkoittaa "polymeraasiketjureaktiota". Wikipedian mukaan sen keksi vuonna 1983 amerikkalainen tiedemies Kary Mullis. Hän sai Nobel-palkinnon löydöstään.

Jonkin aikaa PCR:ää käytettiin vain tieteellisiin tarkoituksiin, jonka jälkeen lääketiede lainasi sen onnistuneesti. Tutkimuksen ydin on tunnistaa tartunnan aiheuttaja DNA- ja RNA-tasolla. Jokainen patogeeni, joka siirtyy DNA:han, muuttaa rakennettaan tietyn tyypin mukaan. Juuri muuttuneen DNA:n tyypin perusteella laborantille käy selväksi, mikä sairaus ihmiskehossa piilee. Muita PCR:n etuja ovat:

1. DNA:han "jälkiä" jättäneen infektion perimmäisen syyn tunnistaminen. Kun useita sairauksia yhdistetään, on vaikea tunnistaa sitä, joka sai alkunsa. Ja varten oikea asetus diagnoosi ja valinta tehokas hoito, ketjureaktiolla on valtava merkitys;
2. PCR ei havaitse vain muuttunutta DNA:ta, vaan myös spesifisen transformaatiokohdan. Tämä on välttämätöntä väärien infektioiden epäilyjen poistamiseksi;
3. PCR-diagnostiikka on niin herkkä, että se havaitsee jopa yksittäiset bakteerit ja virukset. Ne voivat jäädä vereen väärin määrätyn hoidon tai suunnittelemattoman lääkityksen keskeytymisen jälkeen. Minimi diagnostinen määrä klo PCR:n dekoodaus- 10 patogeenisolua. Muut testausmenetelmät eivät ole yhtä tehokkaita;
4. Patogeeniset mikro-organismit havaitaan jopa ilman voimakkaita sukupuolitaudin oireita. Jos tällainen sairaus havaitaan varhaisessa vaiheessa, sen hoito ei kestä yhtä kauan kuin sen pitkälle edenneet muodot;
5. Potilas saa PCR-tulokset melko nopeasti. Infektioiden diagnosointi kestää enintään 4-6 tuntia. Yhdessä salauksen purkamisen kanssa koko prosessi kestää enintään 1-2 päivää;
6. Kerran otettu DNA-materiaali riittää 5-6 näytteen ottamiseksi. Potilaan ei tarvitse tehdä sivelytutkimuksia useita kertoja;
7. PCR ja infektioiden tutkimus eivät pysähdy, tämä alue kehittyy jatkuvasti. Uusia herkempiä testijärjestelmiä kehitetään ja tutkimuksen tekemisen kustannuksia alennetaan. Jos aiemmin se oli vain megakaupunkien asukkaiden saatavilla, nyt alueiden sairaalan lääkärit eivät voi kuvitella tunnistavansa tautia ilman sitä.

PCR-menetelmän ominaisuudet:

1. Tarkkuus (virheet ovat minimaalisia ja niiden taajuus ei ylitä 0,01%);
2. Herkkyys (testi "laskee" yksittäiset bakteerit veressä ja sivelynäöissä);
3. Spesifisyys (PCR havaitsee infektiot, jotka eivät usein ilmene ollenkaan ennen vakavaa vaihetta);
4. Ainutlaatuisuus (testit ovat tehokkaita tilanteissa, joissa muut tutkimukset eivät löydä mitään).

PCR-analyysin tulokset

Miten ketjureaktiomenetelmä toimii, miten valmistaudutaan analyysiin?

Laboratoriossa tapahtuva ketjureaktio sisältää DNA:n ja RNA:n eri osien toistuvan lisääntymisen, jotta löydetään juuri katkennut linkki. Hapot monistetaan (kaksinkertaistetaan) käyttämällä entsyymivalmisteita. Laboratorioteknikko saa entsyymeillä riittävän määrän kopioita patogeenisestä DNA-alueesta voidakseen verrata sen PCR:ää tiettyjen infektion aiheuttamien sairauksien näytteisiin.

Tyypillisesti käytetään biologisia materiaaleja, jotka on otettu näytteenotolla tai vanupuikolla. Tunnistamista varten (sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden selvittäminen) emättimestä, kohdunkaulasta tai virtsaputkesta otetaan näppäily PCR:ää varten. Joskus käytetään myös virtsaa.

Hepatiitin, toksoplasmoosin tai HIV:n olemassaolon vahvistamiseksi tai kumoamiseksi veri otetaan suoneen. Sormenpistosta otettu veri antaa usein vääriä negatiivisia tuloksia. Mononukleoosi diagnosoidaan, kun materiaalia on kerätty nielusta. Tuberkuloosi voidaan havaita ysköksen keräämisen jälkeen, jota vapautuu potilaista aamuisin runsaasti.

Emättimestä ja kohdunkaulasta ottaminen PCR:ää varten on yksinkertainen testi, jota sinun ei pitäisi pelätä. 2-3 päivää ennen sitä sinun on luovuttava seksuaalisesta toiminnasta. Tänä aikana on kiellettyä käyttää emäksisiä geelejä ja saippuoita henkilökohtaiseen hygieniaan. Voit pestä tavallisella lämpimällä vesijohtovedellä. Viimeinen pesu on illalla ennen aamulla käyntiä laboratoriossa tai lääkärin vastaanotolla.

On myös suositeltavaa lopettaa sammashoito voideilla, voiteilla, peräpuikoilla tai suihkeilla, jos niitä tehdään. Näytelmä otetaan muutaman ensimmäisen päivän aikana kuukautisten jälkeen tai välittömästi sen jälkeen. Tarkempien tulosten saamiseksi on suositeltavaa olla käymättä wc:ssä 2-3 tuntiin ennen PCR-näytteen ottamista.

Miehillä virtsaputkesta otetaan vanupuikko ketjureaktion vuoksi. Biologinen materiaali kerätään steriilillä anturilla tai vanupuikolla, joka työnnetään virtsaputkeen. Toimenpiteen aikana saatat kokea lievää epämukavuutta tai polttavaa tunnetta. Miehet joutuvat myös väliaikaisesti luopumaan seksistä ja hygieniatuotteista. Viikkoa ennen analyysiä antibioottien ja muiden lääkkeiden hoito lopetetaan. Jos epämukavuus jatkuu keräyksen jälkeen, on suositeltavaa ottaa yhteyttä klinikkaan mahdollisimman pian.

Oletetaan, että tutkimuksessa käytetään verta tai vanupuikkoa, joka on otettu potilaan sukuelimistä. Geneettinen materiaali asetetaan PCR-vahvistinlaitteeseen ja siihen lisätään entsyymejä. DNA kuumennetaan 90-95 °C:seen, kunnes ketju katkeaa useiksi lenkeiksi. Tätä prosessia kutsutaan denaturaatioksi. Yhdestä DNA- ja RNA-näytteestä syntyy reaktorin käytön aikana tuhansia tulosten analysointiin (reaktion dekoodaamiseen) soveltuvia kopioita.

PCR-diagnostiikkatulokset

Ketjureaktio ei näytä ainoastaan ​​infektion läsnäolon, vaan myös läsnä olevien patogeenien tarkan määrän. Kehitys Viime vuosina- mutaatiogeenien keinotekoinen lisääminen ihmisen DNA:han genotyypin muutokselle alttiuden tunnistamiseksi.

Mitä infektioiden PCR-diagnoosi paljastaa?

Hoitava lääkäri tarkastaa yleensä erikseen testitulosten kopion. Ketjureaktio-ominaisuuksien avulla voit vahvistaa tai kumota seuraavien sairauksien esiintymisen:

Kuten tästä luettelosta ilmenee, PCR-diagnostiikka antaa lääkäreille monia erikoistuneita erikoisuuksia rajattomat mahdollisuudet. Menetelmää voidaan käyttää pulmonologiassa, virologiassa, infektologiassa, onkologiassa, gastroenterologiassa, hematologiassa, gynekologiassa ja urologiassa.

PCR-dekoodaus: tulokset

Vain lääkärit arvioivat ketjureaktiotestejä kullekin potilaalle erikseen ottaen huomioon olemassa olevat patologiat ja krooniset sairaudet. PCR-analyysien tulokset osoittavat, kuten edellä mainittiin, patogeenisten bakteerien kvantitatiiviset ominaisuudet. Heidän kanssaan kuulemalla lääkäri määrittää taudin vakavuuden ja vaiheen. Näiden indikaattoreiden perusteella määrätään myöhemmin lääkkeiden annostus ja hoitojakson kesto.

Negatiivinen PCR-tulos tarkoittaa, että kerätty biologinen materiaali ei sisällä viruksia tai infektioita. Positiivinen PCR on hälytyssignaali. Tämä tarkoittaa, että potilaan verestä ja muista biologisista nesteistä on havaittu infektio.

Jos arvot ovat minimaaliset, tämä voi viitata taudin yksinkertaiseen kantamiseen, ei vain taudin aktiiviseen kehittymiseen. Lääkärin tulee valvoa jatkuvasti yksinkertaista infektion kantajaa, joka havaitaan vain PCR:llä, mutta jolla ei ole muita oireita.

On tärkeää olla panikoimatta ja muistaa se suurin osa tieteen tiedossa viruksia voidaan hoitaa antibakteerisilla lääkkeillä. Vain pätevä asiantuntija, jolla on kokemusta tietyn sairauden hoidosta, voi valita ne ja korvata ne toisilla, jos ne ovat tehottomia.

PCR-dekoodaus voidaan suorittaa paitsi lääkärin pyynnöstä, myös oman harkinnan mukaan. Sen tekevät usein naiset, jotka suunnittelevat raskautta lähitulevaisuudessa varmistaakseen, ettei sukupuolitauteja ole. Kun rekisteröidyt piirineuvontaan, raskaana olevan naisen on silti tehtävä tällainen diagnoosi.

PCR on pakollinen naisille, joilla on ollut useita abortteja tai keskenmenoja monia syitä. Ennen IVF-hoitoa suoritetaan analyysi kaikkien hedelmöitetyn munasolun mahdollisen hylkäämisen syiden poistamiseksi.

Miehillä on tapana tehdä PCR:ää loman jälkeen, jonka aikana heillä oli lomaromantiikka tai jopa useita. Diagnostiikka auttaa heitä olemaan vaarantamatta elämäänsä ja mahdollisten seksikumppaneiden terveyttä.

Usein PCR on ainoa mahdollisuus potilaan päästä eroon taudista alkuvaiheessa kun komplikaatioiden ja vakavan kulun riski on mitätön.