Preciznost molekularne dijagnostike PCR metodom. Lančana reakcija polimerazom (PCR dijagnostika)

Metoda polimeraze lančana reakcija, ili PCR, koristi se u laboratorijskoj dijagnostici većine zarazne bolesti. Omogućava vam da otkrijete genetski materijal mikroorganizama u materijalu koji se proučava i tako ih identificira.

sta je to

Metoda je razvijena 1983. godine, a 1993. njen autor, Mullis, dobio je Nobelovu nagradu.

Osnove metode

Svaka vrsta mikroorganizma, biljka ili životinja ima jedinstven skup hromozoma. Formira ih DNK - deoksiribonukleinska kiselina. Mali fragmenti DNK nazivaju se nukleotidi, a njihova specifična sekvenca čini gen. Svaki gen kodira sintezu jednog proteina, na primjer, kolagena, albumina i svih ostalih. Nukleotidna sekvenca je jedinstvena. Za svaku vrstu živih organizama postoje zajednički dijelovi DNK koji su odgovorni za uniformnost unutar te vrste.

Analiza DNK nekoliko stotina mikroba uključenih u istraživački materijal neće otkriti uzorke vrsta. Potrebno je višestruko povećati broj značajnih genetskih komponenti, što će omogućiti njihovu identifikaciju. Ovaj problem se rješava PCR metodom.

Istraživanje se odnosi na oblast molekularne biologije. DNK polimeraza i slobodni nukleotidi se dodaju mikrobnoj DNK. Polimeraza je enzim koji osigurava višestruke kopije željene regije iz dostupnih nukleotida. Proces započinju prajmeri - kratki ribo pramenovi nukleinske kiseline(RNA) koja se vezuje za početak željenog gena.

Proces analize sastoji se od nekoliko faza, od kojih svaka zahtijeva određeno vrijeme i temperaturni režim. U roku od nekoliko sati, potrebna količina materijala za analizu dobije se od hiljaditi dio grama bakterijske DNK. Moderna oprema omogućava uzastopno kopiranje DNK čak i jedne ćelije, na primjer, sperme.

Napredak studije

Koraci analize:

• uzimanje biološkog materijala (krv, urin, vaginalni sekret, pljuvačka itd.) od pacijentkinje i dostavljanje u laboratorij;
• razdvajanje dva lanca DNK, čijim preplitanjem se formira hromozom, i njihovo pročišćavanje od stranih nečistoća;
• udvostručavanje željenog dijela DNK lanca, kao rezultat toga se povećava njegova količina geometrijska progresija;
• obrada rezultirajućeg materijala s otopinama koje uzrokuju specifičan sjaj rezultirajućih fragmenata DNK, ovo bojenje se koristi za prepoznavanje koja je bakterija ili virus bio u izvoru; Elektroforeza se koristi za razdvajanje frakcija DNK.

Trajanje analize je 4-5 sati.

Prednosti PCR metode

Lančana reakcija polimeraze ima sljedeće prednosti u odnosu na tradicionalne metode za identifikaciju infektivnih agenasa:

• direktno određivanje gena mikroorganizma, za razliku od otkrivanja antitijela na njega u mnogim drugim metodama identifikacije;
• specifičnost, odnosno određivanje specifične vrste patogena;
• osjetljivost: čak i jedna ćelija mikroorganizma je dovoljna za dijagnozu; općenito, potrebna količina patogena je 10 puta manja nego kod drugih metoda;
• raznovrsnost biomaterijala - ne ispituje se samo krv, već i ćelije gustog tkiva, strugotine iz epitela, sluzokože i bilo koje drugo okruženje u kojem bi mogao biti prisutan mikrob;
• brzina dobivanja rezultata je nekoliko puta veća nego pri korištenju drugih metoda;
• sposobnost prepoznavanja kroničnih, sporih i latentnih infekcija;
• dezinfekcija materijala uzetog od pacijenta i sprečavanje kontaminacije laboratorijskog osoblja;
• potpuna automatizacija istraživačkog procesa.

Nedostaci analize

Nedostaci PCR-a uglavnom se odnose na njegovu tehničku složenost:

• potrebno je odabrati prave RNA sekvence - prajmere, a također pripremiti mješavinu nukleotida za sintezu DNK;
• metoda je vrlo osjetljiva, pa ako se u uzorku nalaze različite vrste mikroba, može dati netačne rezultate;
• potrebno je pažljivo očistiti analizirani materijal od nečistoća ljudskih proteina i lijekova, jer smanjuju točnost dijagnoze;
• kontrolno poređenje rezultata sa uzorcima za koje se zna da sadrže ili ne sadrže mikrobiološki materijal, kao i bez DNK uopšte, potrebno je da bi se utvrdile greške i kontaminacija.

Lažno negativni PCR rezultati su uzrokovani kršenjem tehnike analize i promjenama u genetskom slijedu bilo koje komponente reakcije. Lažno pozitivni podaci se javljaju i kada se nukleotidi prajmera i drugih upotrijebljenih reagensa slučajno poklope s jednim od gena mikroorganizma.

Izolacija mikroorganizma ne znači uvijek da je on bio uzrok bolesti. Postoji još jedan problem prilikom analize ljudske DNK: genetske osnove Većina bolesti je još uvijek nepoznata, što onemogućuje dijagnosticiranje neinfektivnih patologija na mikrobiološkom nivou. Ovo je pravac medicinska genetika se veoma aktivno razvija.

Indikacije za PCR testiranje

Ova analiza se koristi u sljedećim situacijama:

• potreba za otkrivanjem i identifikacijom virusa, bakterija, protozoa u bilo kojoj zaraznoj bolesti kada je potrebna dijagnostička točnost;
• identifikacija pojedinca upoređivanjem sa genetskim materijalom poznatog porijekla;
• analiza tkiva dobijenih tehnikom tanke igle, koje je vrlo teško pregledati drugim metodama;
• dijagnoza leukemije i malignih tumora;
• provođenje eksperimenata sa usađivanjem embrionalnih matičnih stanica kod životinja (zabranjena je upotreba takvih stanica kod ljudi), kao i uzgoj linija laboratorijskih miševa s unaprijed određenom genetskom bolešću.

Izgledi za upotrebu PCR reakcije i njene varijacije u medicini i biologiji zaokupljaju maštu - od testiranja novih lijekova na nivou gena do stvaranja transgenih organizama sa određenim svojstvima. Rad u ovom pravcu odvija se u najvećim laboratorijama u svijetu, što pomaže da se PCR metoda unaprijedi na primijenjenom nivou za dijagnostiku zaraznih bolesti ljudi.

U medicini se PCR metoda obično koristi za dijagnosticiranje i procjenu učinkovitosti liječenja sljedećih bolesti:

• intracelularne infekcije, na primjer, ili;
• bolesti koje se prenose seksualnim kontaktom;
• Helicobacter pylori infekcija i mnoge druge.

Priprema za studij

3 dana pre testa morate prestati da pijete alkohol. Neki lijekovi, kao što su antibiotici, se prekidaju po preporuci ljekara.

Pravila za pripremu kod dijagnosticiranja polno prenosivih infekcija:

• 2 dana prije testa prekinuti seksualni odnos;
• 2 sata prije testa nemojte mokriti;
• nemojte ispirati noć prije i ujutro; samo se operi toplu vodu nema deterdženata;
• nemojte raditi PCR testove tokom i 4 dana nakon (kod žena).

Opća pravila pripreme:

• 2 dana unaprijed, isključuje intenzivno fizička aktivnost, sport;
• ujutro na dan ispitivanja ne pušite i ne jedite hranu;
• Ako se materijal uzima iz usta i nazofarinksa, nemojte prati zube ujutro.

Od ovog jednostavna pravila Ovisi pouzdanost ove precizne, ali skupe dijagnostičke metode. Nezavisna interpretacija rezultata neće pružiti potrebne informacije o bolesti i njenom liječenju. Zbog toga, nakon dobijanja podataka PCR testa, potrebno je da se obratite lekaru.

Kome lekaru da se obratim?

Ako se sumnja na spolno prenosivu bolest, ginekolog, urolog, androlog ili venerolog će vas uputiti na PCR. Studiju za hepatitis i HIV infekciju propisuje specijalista za infektivne bolesti, a za tuberkulozu - ftizijatar. PCR u svojoj praksi koriste liječnici mnogih specijalnosti, na primjer, onkolozi, hematolozi, gastroenterolozi i genetičari.

Ljudi su prvi put počeli govoriti o PCR analizi 1983. godine. Ovu tehniku ​​je razvio Kary Mullis i članovi njegove laboratorije. Od tada popularnost studije stalno raste, jer ima značajan broj prednosti u odnosu na druge metode.

Danas je PCR dijagnostika mjerilo ili standard u identifikaciji infekcija i patogena, posebno onih koji su asimptomatski. Prije svega, ovo je pretklinička dijagnostika.

Izvođenje analize u PCR mašini

Suština PCR analize je da se sekvence nukleinskih kiselina (DNK ili RNA) karakteristične za određenu vrstu patogena kloniraju (višestruko uvećane) u epruveti.

Skraćenica PCR označava lančanu reakciju polimeraze.

Dom razlikovna karakteristika ove metode je amplifikacija, tj. stvaranje ogromnog broja kopija potrebnog gena ili njegovog fragmenta. Sve se to proizvodi izvan tijela, tj. in vitro.

Dakle, ako se provede 20 PCR ciklusa, onda se dobije približno 1 milion kopija ili više. To omogućava otkrivanje infekcije čak i kada je njena količina u izvornom materijalu neznatna, kada su druge metode analize nemoćne. Ovo određuje visoku osjetljivost ove metode.

Jednostavnim riječima, možete povući sljedeću analogiju: nećete primijetiti jedno malo zrno pijeska na podu, ali nakon povećanja broja zrna pijeska milion puta (PCR), gomila pijeska će već biti jasno vidljiva .

Glavne prednosti testiranja na infekcije PCR metodom su:

• najveća osetljivost i specifičnost u poređenju sa drugim metodama koje se koriste za otkrivanje infektivnih agenasa;
• sposobnost otkrivanja mikroorganizama u raznim biološkim materijalima (krv, urin, vaginalni sekret, pljuvačka, itd.);
• sposobnost istovremenog identificiranja nekoliko uzročnika mikroorganizama, ako ih ima. Poređenja radi, upotreba bakterioloških metoda ne pruža takvu mogućnost, jer potrebna aplikacija različitim okruženjima za uzgoj različitih patogenih mikroba;
• mogućnost transporta biološkog materijala, jer Za identifikaciju patogena nije potrebno održavati ga živim;
• brzina analize;
• tačnost etiološke dijagnoze;
• mogućnost kvantitativnog određivanja patogena - posebno važno za oportunističke mikrobe, koji tek nakon postizanja određene koncentracije mogu izazvati bolest;
• sposobnost kontrole toka infektivnog procesa tokom liječenja.

PCR analiza za infekcije

Trenutno se većina spolno prenosivih (i drugih) zaraznih bolesti utvrđuje metodom lančane reakcije polimeraze. Dijagnostika je postala široko rasprostranjena zbog svoje visoke osjetljivosti i specifičnosti.

Posebno je popularna PCR analiza na klamidiju.

To je zbog činjenice da ovi mikroorganizmi žive intracelularno, što stvara određene poteškoće u njihovom otkrivanju.

PCR dijagnostika omogućuje otkrivanje čak i minimalne količine klamidije, koja u pravilu još ne dovodi do pojave kliničkih simptoma. Čak i prisustvo samo 2 molekula nukleinskih kiselina u ispitivanom materijalu omogućava identifikaciju uzročnika infekcije.

A to je ključ uspješnog liječenja, koje počinje u pretkliničkoj fazi.

Infekcije se takođe utvrđuju:

• virusni hepatitis;
• tuberkuloza;
• krpeljni encefalitis;
• razne polno prenosive bolesti itd.

PCR dijagnostika vam omogućava da riješite niz drugih važnih problema:

• praćenje terapije i procena njene efikasnosti;
• određivanje "opterećenja virusom", na osnovu kojeg se odabire pojedinačna doza lijeka;
• identifikacija sojeva mikroorganizama koji su farmakološki otporni (neosjetljivi na lijekove).

Priprema za test

Nema potrebe da se posebno pripremate za test koji će se obaviti PCR metodom. Međutim, vrlo je važno da stručnjak prikupi materijal u skladu sa svim neophodni uslovi sterilitet.

Tako, na primjer, treba koristiti posebne vakuum sisteme za vađenje krvi, posebne cijevi za uzimanje genitalnog sekreta itd.

U nekim slučajevima materijal se mora transportovati u laboratoriju. Da biste to učinili ispravno, potrebno je hermetički zatvoriti posudu biološkim materijalom. To će spriječiti prodor drugih mikroorganizama koji žive u vanjskom okruženju.

Rezultati PCR analize mogu biti na dvije opcije:

• pozitivno – otkriven je patogen;
• negativan – patogen nije identificiran.

Trebali biste znati da se čak i bez kliničkih simptoma može dobiti pozitivan rezultat.

U ovom slučaju, potrebno je fokusirati se na podatke o reakciji polimeraze, jer omogućava vam da identifikujete bolest u pretkliničkoj fazi.

Ponekad se može dobiti upitan odgovor kada broj otkrivenih kopija odgovara gornjoj granici normale. Da bi se razjasnio uzrok bolesti, analizu treba ponoviti, obraćajući posebnu pažnju na uslove za prikupljanje biološkog materijala.

Koliko je tačna PCR dijagnostika?

Glavne prednosti PCR dijagnostike mogu se formulirati u obliku nekoliko teza:

• mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija patogenih mikroorganizama;
• veliki broj kopija je ključ uspješnog sekvenciranja (detekcije).

Ovo osigurava visoku tačnost PCR analize za detekciju intracelularnih patogena i spororastućih mikroorganizama.

Stoga je metoda posebno informativna za identifikaciju tuberkuloznih mikobakterija i drugih sličnih infektivnih agenasa. Ima najveću preciznost i nije potrebno dvostruko provjeravati dobijene rezultate (osim u povremenim slučajevima).

Za dobijanje najpouzdanijih rezultata potrebno je ispuniti dva osnovna uslova koji sprečavaju egzogenu (vanjsku) infekciju:

• pravilan odabir materijala;
• ispravan transport.

Stranica pruža pozadinske informacije samo u informativne svrhe. Dijagnoza i liječenje bolesti moraju se provoditi pod nadzorom specijaliste. Svi lijekovi imaju kontraindikacije. Konsultacija sa specijalistom je obavezna!

U kojim oblastima medicine se koristi ova metoda?

• Izolujte i klonirajte gene.
• Dijagnostikovanje genetskih i zaraznih bolesti.
• Utvrditi očinstvo. Dijete nasljeđuje neke od svojih genetskih karakteristika od svojih bioloških roditelja, ali ima svoj jedinstveni genetski identitet. Prisustvo nekih gena koji su identični genima roditelja omogućava nam da govorimo o uspostavljanju veze.

Na mjestima zločina forenzičari prikupljaju uzorke genetskog materijala. To uključuje: kosu, pljuvačku, krv. Nakon toga, zahvaljujući tehnici reakcije polimeraze, DNK se može pojačati, a identitet uzetog uzorka može se uporediti sa genetskim materijalom osumnjičene osobe.

Lančana reakcija polimeraze se efikasno koristi u medicini:

• U pulmološkoj praksi - za razlikovanje bakterijskih i virusnih vrsta pneumonije, tuberkuloze.
• U ginekološkoj i urološkoj praksi - za određivanje ureaplazmoze, klamidije, mikoplazma infekcije, gardnereloze, herpesa, gonoreje.
• U gastroenterološkoj praksi.
• U hematologiji - za određivanje onkovirusa i citomegalovirusne infekcije.
• U brzoj dijagnostici zaraznih bolesti kao što su virusni hepatitis, difterija, salmoneloza.

Trenutno najčešći ovu metodu u dijagnostici zaraznih bolesti ( hepatitis virusne etiologije, HIV, polno prenosive bolesti, tuberkuloza, krpeljni encefalitis).

Šta se dešava tokom reakcije?

Reakcija polimeraze omogućava otkrivanje infekcije, čak i ako uzorak koji sadrži biološki materijal sadrži samo jedan ili više molekula DNK patogena.

Tokom reakcije, zahvaljujući enzimu DNK polimerazi, dolazi do udvostručavanja ( replikacija) dio DNK. Sama deoksiribonukleinska kiselina ( skraćeno kao DNK) je važno za nas jer osigurava skladištenje i prijenos genetskih informacija do ćelija kćeri. DNK ima oblik heliksa, koji se sastoji od blokova koji se ponavljaju. Ovi blokovi čine nukleotide, koji su najmanja čestica DNK. Nukleotidi se formiraju od aminokiselina.

Proces replikacije DNK sekcija odvija se tokom ponovljenih ciklusa. U svakom takvom ciklusu ne kopira se i udvostručuje se ne samo originalni fragment DNK, već i oni fragmenti koji su već udvostručeni u prethodnom ciklusu amplifikacije. Sve ovo liči na proces geometrijske progresije.

Postoji:

• Prirodno pojačanje ( odnosno proces kopiranja i umnožavanja DNK), koji se javlja u našem tijelu i deterministički je, unaprijed određen proces.
• Umjetna amplifikacija, koja nastaje zbog lančane reakcije polimeraze. U ovom slučaju, proces kopiranja je kontroliran i omogućava umnožavanje čak i kratkih dijelova nukleinske kiseline.

Nakon trideset do četrdeset ciklusa, broj fragmenata dostiže nekoliko milijardi.

Za pojačanje in vitro (in vitro) potrebno je da određeni strani fragment DNK ( to jest, DNK nije od pacijenta, već od patogena). Ako stvorena otopina ne sadrži određeni fragment, neće doći do lančane reakcije pod djelovanjem polimeraze. Ovo objašnjava činjenicu visoke specifičnosti PCR-a.

Faze PCR dijagnostike

6. Izvođenjem elektroforeze rezultati se sumiraju i izračunavaju se rezultati udvostručenja.

Koje su prednosti ove dijagnoze?

• Svestranost: Bilo koji uzorak nukleinske kiseline je pogodan za ovu metodu.
• Visoka specifičnost: patogen ima jedinstvene sekvence DNK lanaca koji su specifični za njega. Stoga će rezultati PCR-a biti pouzdani, nemoguće je pobrkati gen jednog patogena s genom drugog patogena.
• Osetljivost na prisustvo čak i jednog molekula patogena.

• Mala količina materijala potrebna za istraživanje. Čak i kap krvi može. Mogućnost dobijanja rezultata korišćenjem minimalne zapremine uzorka veoma je važna za pedijatrijske, neonatološke, neurološke studije, kao i u praksi sudske medicine.
• Sposobnost utvrđivanja indolentne, kronične infekcije, a ne samo akutne.
• Mnoge patogene kulture je vrlo teško uzgajati in vitro drugim metodama, i polimerazna reakcija omogućava razmnožavanje usjeva u potrebnoj količini.

Koje nedostatke ima ova dijagnoza?

• Ako materijal namijenjen za PCR sadrži DNK ne samo živog patogena, već i mrtvog, doći će do amplifikacije oba DNK. Shodno tome, liječenje propisano nakon dijagnoze možda neće biti potpuno ispravno. Nakon nekog vremena, bolje je pratiti efikasnost liječenja.
• Povećana osjetljivost na prisustvo mikroorganizama također se može smatrati, na neki način, nedostatkom. Uostalom, ljudsko tijelo inače sadrži oportunističku mikrofloru, odnosno, to su mikroorganizmi koji žive u crijevima, želucu i dr. unutrašnje organe. Ovi mikroorganizmi mogu nanijeti štetu ljudima samo pod određenim nepovoljnim uvjetima - nepoštivanjem higijenskim zahtjevima, kontaminirana voda za piće itd. PCR tehnika umnožava DNK čak i ovih mikroorganizama, iako ne dovode do patologije.
• PCR različitih test sistema može pokazati rezultate koji će se međusobno razlikovati. Postoje mnoge modifikacije ove tehnike: “ ugniježđen», « asimetrično», « obrnuto», « kvantitativno» PCR i drugi.

Moderne visokotehnološke metode laboratorijska istraživanja omogućavaju nam da identifikujemo bolesti u ranoj fazi. Zarazne bolesti se razvijaju i razvijaju, postaju sve brojnije i sve ih je teže prepoznati. Dijagnostika metodom PCR (lančana reakcija polimeraze) jedna je od najnovijih i najpreciznijih. Za njegov razvoj naučnik Kary Mullis dobio je Nobelovu nagradu.

Lančana reakcija polimeraze– metoda molekularne genetičke dijagnostike koja omogućava pronalaženje različitih vrsta infektivnih i nasljednih patologija kod ljudi, kako u akutnim tako iu hronični oblik i mnogo prije nego što se patologija počne manifestirati. Većina ljekara svakodnevno se susreće sa ovom analizom i više ne mogu zamisliti kako je bez nje moguće postaviti ispravnu dijagnozu i stadij bolesti.

Suština PCR dijagnostike

PCR analiza koristi principe molekularne biologije. Koristi posebne enzime koji više puta kopiraju fragmente RNK i DNK, kao i mikroorganizme koji uzrokuju bolesti i nalaze se u ljudskim biološkim materijalima. Kopiranje se odvija u nekoliko faza, pa nastaje lančana reakcija. Nakon toga, laboratorijski stručnjaci uspoređuju dobivene podatke sa zajedničkom bazom podataka i identificiraju uzročnike bolesti, kao i njihovu koncentraciju. Dijagnoza se vrši u specijalni uređaj, koji hladi i zagrijava epruvetu s biomaterijalom i naziva se termalni ciklus. Usklađenost s temperaturnim režimom utiče na istinitost rezultata analize.

Fragmenti DNK mikroorganizama mogu biti sadržani u sljedećim biološkim materijalima:

• biološke tekućine;
• krv i njeni derivati;
• struganje epitelnih ćelija ili razmaza;
• urin;
• sputum;
• sluz i druge biološke sekrecije;
• biopatije sluzokože gastrointestinalnog trakta.

Gdje se koristi PCR dijagnostika?

Mogućnosti za dijagnosticiranje zaraznih bolesti pomoću polimerazne lančane reakcije su velike. Može se koristiti za identifikaciju širokog spektra virusa koji uzrokuju infekcije kao što su:

Ovo nije puna lista bolesti koje se otkrivaju PCR analizom. Većina ovih patologija jeste ranoj fazi su praktički neprimjetne, ali su posljedice njihovog utjecaja na organizam izrazito negativne i često opasne po zdravlje i život ljudi.

Trudnicama se propisuje PCR test za otkrivanje polno prenosivih infekcija koje značajno povećavaju rizik od raka grlića materice i štetno utiču na tok trudnoće i zdravlje djeteta. Stoga je dijagnosticiranje spolno prenosivih bolesti izuzetno važno kako bi se spriječila infekcija fetusa patogenim mikroorganizmima.

Na osnovu svega navedenog možemo zaključiti da laboratorijska dijagnostika korišćenje PCR metode pomaže lekaru da postavi tačnu dijagnozu i prepiše efikasnu terapiju u svakom pojedinačnom slučaju.

Ovo je zanimljivo! Osim u medicini, PCR metoda se koristi i u drugim oblastima, na primjer, u forenzici, kada je potrebno utvrditi ko je vlasnik biomaterijala pronađenog na mjestu zločina, a ponekad se PCR koristi za utvrđivanje očinstva, za provođenje eksperimenata sa DNK mutacija i drugi eksperimenti.

Prednosti i mane metode

Prednosti PCR dijagnostike su:

• visoka osjetljivost testa omogućava identifikaciju čak i pojedinačnih uzročnika patogena, što omogućava identifikaciju patologije u ranoj fazi, u kroničnim i latentnim oblicima;
• svestranost metode omogućava korištenje gotovo bilo kojeg biomaterijala za istraživanje, od pljuvačke do stanica kože;
• velika pokrivenost - prilikom pregleda jednog uzorka moguće je utvrditi prisustvo više različitih patogena;
• tačnost - visok nivo Ova metoda ispitivanja vam omogućava da ne dajete lažne pokazatelje;
• brzina - rezultat je spreman u prosjeku za pet sati, odnosno pacijent može preuzeti zaključak sljedeći dan nakon predaje biomaterijala;
• relativno niska cijena– ova dijagnostička metoda se po cijeni ne razlikuje od ostalih laboratorijske pretrage krv;
• Ovom metodom može se napraviti pretklinička i retrospektivna dijagnostika. Prvi identifikuje patogene mikroorganizme čak i prije početka bolesti, a drugi se provodi nakon što je patologija pretrpjela, što vam omogućava da spriječite razvoj patologije i izliječite je na vrijeme, kao i da odredite latentni oblik patologije. bolest koja se javlja bez očiglednih simptoma.

Ali ne postoje savršene dijagnostičke metode, tako da PCR ima i nedostatke:

• visoki zahtjevi za usklađenost s tehnološkim procesom;
• visoki zahtjevi za profesionalnošću laboratorijskih tehničara.

Savjet! Ovakvu analizu je bolje raditi samo u najboljim i najprofesionalnijim laboratorijama, gdje su implementirani strogi sistemi kontrole kvaliteta.

Za pouzdanost rezultata potrebno je pridržavati se pravila za preliminarnu pripremu za analizu:

• kada donirate pljuvačku, ne biste trebali jesti ili piti lijekove četiri sata prije zahvata, morate isprati usta prokuhanom vodom, a zatim obaviti laganu masažu kože kako bi se izlučio iz žlijezde;
• Urin se obično sakuplja kod kuće. Prije toga potrebno je oprati genitalije i sakupiti 50 ml prvog jutarnjeg urina u posebnu posudu, nije preporučljivo sakupljati materijal za vrijeme menstruacije;
• Prije davanja sperme muškarac ne smije imati seksualne odnose tri dana, ne smije ići u saunu, ne kupati se u vrućoj kupki, ne uzimati alkoholna pića ili začinjenu hranu. Neposredno prije testa, zabranjeno je mokriti tri sata;
• Za uzimanje urogenitalnog brisa preporučuje se da nemate seksualne odnose tri dana. Dvije sedmice prije testa zabranjeno je uzimanje antibakterijskih lijekova. Na tjedan dana morate prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne supozitorije i ispiranje. Tri sata prije uzimanja biomaterijala morate se suzdržati od odlaska u toalet.
• Krv se daje ujutro na prazan želudac.

Materijal za dijagnostiku treba prikupljati u uslovima koji sprečavaju njegovu kontaminaciju, jer to može značajno uticati na verodostojnost PCR rezultata.

Transkript analize

Test može pokazati pozitivan ili negativan rezultat. Negativno znači da u tijelu nema sumnje na infekciju i da je osoba zdrava. Pozitivan kaže da je pacijent bolestan i da mu je potrebno liječenje. Svi pokazatelji moraju biti dešifrovani i izraženi od strane doktora. Ne biste trebali biti uznemireni ili se bojati loših rezultata na temelju njih;

Da li vam se svidio naš članak? Podijelite sa prijateljima na društvenim mrežama. mreže ili ocijenite ovu objavu:

(još nema ocjena)

Ja sam ljekar opšte prakse, specijalista opšte prakse. Moja kompetencija obuhvata pitanja rane dijagnoze pacijenata i lečenje mnogih bolesti gastrointestinalnog trakta, pluća i respiratornog trakta, jetra, bubrezi, kardiovaskularni i genitourinarni sistem, kožne bolesti, metabolički poremećaji itd. 15 godina iskustva kao ljekar opšte prakse u moskovskim klinikama, od kojih je 5 radilo u jednoj bolnici u Sankt Peterburgu. Rado ću odgovoriti na pitanja sa mog bloga čitalaca.

PCR je dijagnostika infekcija, moderan i vrlo precizan način otkrivanja različitih zaraznih bolesti. Po čemu se razlikuje od drugih analiza?

Ova skraćenica znači "lančana reakcija polimeraze". Prema Wikipediji, izumio ga je 1983. godine Kary Mullis, američki naučnik. Za svoje otkriće dobio je Nobelovu nagradu.

Neko vrijeme PCR se koristio samo u naučne svrhe, nakon čega ga je medicina uspješno posudila. Suština studije je prepoznavanje infektivnog agensa na nivou DNK i RNK. Svaki patogen, uvodeći se u DNK, mijenja svoju strukturu prema određenom tipu. Upravo izgledom izmijenjene DNK laboratorijskom asistentu postaje jasno koja se bolest krije u ljudskom tijelu. Ostale prednosti PCR-a uključuju:

1. Identificiranje osnovnog uzroka infekcije koja je ostavila "tragove" u DNK. Kada se kombinuje više bolesti, teško je identifikovati onu koja je sve pokrenula. I za ispravno podešavanje dijagnoza i selekcija efikasan tretman lančana reakcija je od ogromne važnosti;
2. PCR detektuje ne samo promenjenu DNK, već i specifično mesto transformacije. Ovo je neophodno kako bi se otklonile sumnje o lažnim infekcijama;
3. PCR dijagnostika je toliko osjetljiva da otkriva čak i pojedinačne bakterije i viruse. Mogu ostati u krvi nakon pogrešno propisanog liječenja ili neplaniranog prekida uzimanja lijekova. Minimalna dijagnostička količina na dekodiranje PCR- 10 patogenih ćelija. Druge metode testiranja nisu tako efikasne;
4. Patogeni mikroorganizmi se otkrivaju čak iu odsustvu izraženih simptoma spolno prenosivih bolesti. Ako se takva bolest otkrije u ranoj fazi, liječenje ne traje toliko dugo kao njeni uznapredovali oblici;
5. Pacijent prima rezultate PCR-a prilično brzo. Dijagnostikovanje infekcija traje ne više od 4-6 sati. Zajedno s dešifriranjem, cijeli proces ne traje više od 1-2 dana;
6. Jednokratno uzet DNK materijal dovoljan je za 5-6 uzoraka. Pacijent neće morati da se podvrgava brisevima nekoliko puta;
7. PCR i proučavanje infekcija ne stoji mirno; Izmišljaju se novi sistemi za testiranje povećane osjetljivosti, a smanjuju se troškovi provođenja istraživanja. Ako je ranije bio dostupan samo stanovnicima megagradova, sada liječnici na stacionarnim klinikama u regijama ne mogu zamisliti identifikaciju bolesti bez nje.

Karakteristike PCR metode:

1. Preciznost (greške su minimalne i njihova učestalost ne prelazi 0,01%);
2. Osjetljivost (test „izračunava“ pojedinačne bakterije u krvi i razmazu);
3. Specifičnost (PCR otkriva infekcije koje se često ne manifestiraju do teške faze);
4. Jedinstvenost (testovi su efikasni u situacijama kada druge studije ne pronalaze ništa).

Rezultati PCR analize

Kako funkcionira metoda lančane reakcije, kako se pripremiti za analizu?

Lančana reakcija u laboratoriji uključuje ponavljanu reprodukciju različitih dijelova DNK i RNK kako bi se pronašla vrlo prekinuta karika. Kiseline se pojačavaju (udvostručuju) pomoću enzimskih preparata. Koristeći enzime, laboratorijski tehničar dobija dovoljan broj kopija patogene regije DNK da uporedi svoj PCR sa uzorcima određenih bolesti uzrokovanih infekcijom.

Obično se koriste biološki materijali uzeti uzorkovanjem ili brisom. Za identifikaciju (dešifrovanje polno prenosivih infekcija) uzima se bris iz vagine, grlića materice ili uretre za PCR. Ponekad se koristi i urin.

Da bi se potvrdilo ili opovrglo prisustvo hepatitisa, toksoplazmoze ili HIV-a, uzima se krv iz vene. Krv uzeta ubodom prsta često daje lažno negativne rezultate. Mononukleoza se dijagnosticira nakon prikupljanja materijala iz ždrijela. Tuberkuloza se može otkriti nakon sakupljanja sputuma, koji se ujutro obilno oslobađa iz pacijenata.

Bris iz vagine i grlića materice za PCR jednostavan je test kojeg se ne biste trebali bojati. 2-3 dana prije postupka potrebno je suzdržati se od seksualne aktivnosti. U isto vrijeme zabranjeno je korištenje gelova i sapuna na bazi alkalija za ličnu higijenu. Možete oprati običnom toplom vodom iz slavine. Posljednje pranje je uveče prije jutarnje posjete laboratoriji ili ordinaciji.

Također je preporučljivo prestati liječiti drozd kremama, mastima, supozitorijama ili sprejevima, ako se provodi. Bris se uzima prvih nekoliko dana nakon menstruacije ili neposredno nakon nje. Da biste dobili preciznije rezultate, preporučuje se da ne odlazite u toalet 2-3 sata prije uzimanja PCR brisa.

Kod muškaraca se uzima bris iz uretre radi lančane reakcije. Biološki materijal se prikuplja sterilnom sondom ili pamučnim štapićem umetnutim u uretru. Tokom postupka možete osjetiti blagu nelagodu ili osjećaj peckanja. Muškarci će također morati privremeno odustati od seksa i higijenskih proizvoda. Sedmicu prije analize prekida se liječenje antibioticima i drugim lijekovima. Ako tegobe ne prestanu nakon uzimanja, preporučuje se što prije kontaktirati kliniku.

Recimo da studija koristi krv ili bris uzet sa genitalija pacijenta. Genetski materijal se stavlja u uređaj za PCR pojačalo i tu se dodaju enzimi. DNK se zagrijava na 90-95°C dok se lanac ne razbije na nekoliko karika. Ovaj proces se naziva denaturacija. Tokom rada reaktora, iz jednog uzorka DNK i RNK stvaraju se hiljade njegovih kopija pogodnih za analizu (dekodiranje reakcije) rezultata.

Rezultati PCR dijagnostike

Lančana reakcija pokazuje ne samo prisustvo infekcije, već i tačan broj prisutnih patogena. Razvoj poslednjih godina- umjetno unošenje mutacijskih gena u ljudsku DNK radi utvrđivanja predispozicije za promjenu genotipa.

Šta otkriva PCR dijagnostika infekcija?

Prepis rezultata testa obično posebno pregleda ljekar koji prisustvuje. Mogućnosti lančane reakcije omogućavaju vam da potvrdite ili opovrgnete prisustvo sljedećih bolesti:

Kao što je jasno iz ove liste, PCR dijagnostika daje lekarima mnogih specijalizovanih specijalnosti neograničene mogućnosti. Metoda se može koristiti u pulmologiji, virologiji, infektologiji, onkologiji, gastroenterologiji, hematologiji, ginekologiji i urologiji.

PCR dekodiranje: rezultati

Testove lančane reakcije procjenjuju samo liječnici pojedinačno za svakog pacijenta, uzimajući u obzir postojeće patologije i kronične bolesti. Rezultati PCR analiza ukazuju, kao što je već navedeno, na kvantitativne karakteristike patogenih bakterija. Konsultujući ih, lekar će utvrditi težinu i stadijum bolesti. Na osnovu ovih pokazatelja naknadno se propisuju doziranje lijekova i trajanje tijeka liječenja.

Negativan PCR rezultat znači da u prikupljenom biološkom materijalu nema manifestacija virusa ili infekcija. Pozitivan PCR je signal za uzbunu. To znači da je infekcija otkrivena u krvi i drugim biološkim tečnostima pacijenta.

Ako su vrijednosti minimalne, to može ukazivati ​​na jednostavno prenošenje bolesti, a ne samo na aktivan razvoj bolesti. Jednostavan nosilac infekcije, koji je otkriven samo PCR-om, ali ne pokazuje nikakve druge simptome, trebao bi biti pod stalnim nadzorom liječnika.

Važno je ne paničariti i zapamtiti to većina poznato nauci virusi se mogu liječiti antibakterijskim lijekovima. Samo kvalificirani stručnjak s iskustvom u liječenju određene bolesti može ih odabrati i zamijeniti jedan drugim ako su neučinkoviti.

PCR dekodiranje se može izvršiti ne samo na zahtjev liječnika, već i po vlastitom nahođenju. Često to rade žene koje planiraju trudnoću u bliskoj budućnosti kako bi se uvjerile da nema polno prenosivih bolesti. Prilikom registracije u okružnom savjetovanju, trudnica će i dalje morati proći ovu vrstu dijagnoze.

PCR je obavezan za žene koje su imale nekoliko pobačaja ili pobačaja raznih razloga. Prije vantjelesne oplodnje radi se analiza kako bi se otklonili svi uzroci mogućeg odbacivanja oplođene jajne stanice.

Muškarci imaju tendenciju da provode PCR nakon odmora, tokom kojeg je bilo praznične romanse ili čak nekoliko. Dijagnostika im pomaže da ne ugroze svoje živote i zdravlje potencijalnih seksualnih partnera.

Često PCR postaje jedina šansa za pacijenta da se riješi bolesti početna faza kada je rizik od komplikacija i teškog toka zanemarljiv.