Meetod rekombinantsete hübriidplasmiidide loomiseks. Kokkuvõte: Rekombinantsed valgud

9384 0

DNA molekulide uurimine

Rekombinantne DNA sisaldab geeni (või geene) ja vektorit. Vektor on DNA fragment, mis tagab hübriid-DNA paljunemise ja geneetilise süsteemi lõppproduktide – valkude sünteesi. Peamised uuringud viidi läbi bakterite ja viirustega, kuna need on ühed kõige enam lihtsad organismid, muidu nimetatakse neid "peremeesrakkudeks". Rekombinantne DNA tehnoloogia võimaldab saada geneetiliselt muundatud variante sihipäraselt ja rangelt kontrollitud viisil.

Kuidas saab kõrgemate organismide geene bakterirakkudesse viia? Kõige levinum geenitehnoloogia meetod on rekombinantse, s.t võõrast geeni sisaldava DNA saamise meetod, plasmiidid. Plasmiidid on ringikujulised kaheahelalised DNA molekulid, mis koosnevad mitmest tuhandest aluspaarist. Iga bakter võib lisaks põhilisele DNA molekulile (5106 aluspaari), mis rakust ei lahku, sisaldada mitut erinevat plasmiidi, mida ta vahetab teiste bakteritega.

Plasmiidid on autonoomsed geneetilised, paljunedes (st paljunedes) bakterirakus erineval ajal kui peamine DNA molekul. Kuigi plasmiidid moodustavad vaid väikese osa raku DNA-st, kannavad nad selliseid bakterite jaoks olulisi geene nagu ravimiresistentsuse geenid. Erinevad plasmiidid sisaldavad erinevaid antibakteriaalsete ravimite resistentsuse geene. Plasmiidide lihtsust ja kergust, millega nad bakteritesse "sisenevad" ja "väljuvad", kasutavad geeniinsenerid kõrgemate organismide geenide sisestamiseks bakterirakkudesse.

1974. aastal avastatud restriktsiooniendonukleaasid ehk restriktsiooniensüümid on võimsad geenitehnoloogia vahendid.

Piirang tähendab sõna-sõnalt "piirangut". Bakterirakud toodavad võõrkehade (peamiselt faagi DNA) hävitamiseks restriktsiooniensüüme, mis on vajalikud viirusnakkuse piiramiseks. Restriktsiooniensüümid "tunnevad ära" DNA teatud nukleotiidide järjestused (nn äratundmissaidid) ja viivad DNA ahelatesse sümmeetrilised katkestused saidi keskpunktist võrdsel kaugusel. Selle tulemusena moodustuvad iga piiratud DNA fragmendi otstes lühikesed üheahelalised "sabad", mida nimetatakse "kleepuvateks otsteks".

Erinevat tüüpi bakteritest on eraldatud umbes viissada erinevat restriktsiooni, mille jaoks on kirjeldatud restriktsioonisaite.

Geenitehnoloogia meetodid

Kogu selliste bakterite hankimise protsessi nimetatakse kloonimiseks. See koosneb järjestikustest etappidest (joonis 3.3):
1. Piirangud - inimese DNA lõikamine restriktsiooniensüümiga paljudeks erinevateks fragmentideks, kuid samade "kleepuvate" otstega. Samad otsad saadakse plasmiidse DNA lõikamisel sama restriktsiooniensüümiga.

Riis. 3.3. Geeni sisestamine Escherichia coli plasmiidi ja selle geeni kloonimine Escherichia coli rakkudesse
E. coli plasmiidi lõikab restriktsiooniendonukleaas mõlemas DNA ahelas kindlas kohas, nii et lühikesed paarimata desoksüribonukleotiidjärjestused (TTAA või AATT) paiknevad lõhustatud plasmiidi otstes, st igaüks neli nukleotiidi, milles aluseid esindavad tümiin ja adeniin.
Plasmiidi sisestatav geen lõhustatakse sama restriktsiooniensüümiga, nii et selle otsad on komplementaarsed plasmiidi otstes olevate nukleotiidjärjestustega (AATT ja TTAA).
Mõlemad DNA (geen ja plasmiid) ligeeritakse ligaasi kasutades. Seejärel viiakse rekombinantne plasmiid E. coH rakku, mis paljunedes moodustab klooni, mille kõik rakud sisaldavad rekombinantset plasmiidi ja seega ka võõrgeeni. Viimane on nüüd kloonitud Escherichia coli rakkudesse ja indutseerib selles spetsiifilise valgu sünteesi.

3. Transformatsioonid - rekombinantsete plasmiidide viimine spetsiaalsel viisil töödeldud bakterirakkudesse - nii et need muutuvad lühikeseks ajaks makromolekulidele läbilaskvaks. Plasmiidid tungivad aga läbi ainult osa töödeldud bakteritest. Need eraldatakse spetsiifilise toitekeskkonna (näiteks antibiootikumilahuse) abil. Iga transformeeritud bakter paljuneb ja moodustab paljudest tuhandetest järglastest koosneva koloonia – klooni.

4. Skriinimine – transformeeritud bakterite kloonide seast valimine, mis säilitavad inimese geeni kandvaid plasmiide.

Soovitud geeni ei ole alati võimalik restriktaaside abil täpselt lõigata. Need ensüümid lõhustavad paljud geenid mitmeks osaks või ei sisalda restriktsiooniensüümide poolt äratuntavaid järjestusi. Seetõttu ei alga mõnel juhul kloonimise protsess mitte juhuslike DNA fragmentide kromosoomidest väljalõikamisega, vaid soovitud geeni sihipärase tootmisega.

Selleks eraldatakse inimese rakkudest mRNA, mis on selle geeni transkriptsiooniline koopia ja ensüümi - pöördtranskriptaasi (revertaas) - abil sünteesitakse komplementaarne DNA ahel, misjärel mRNA, mis toimib DNA sünteesi matriitsi hävitab RNaas - spetsiaalne ensüüm, mis on võimeline RNA ahelat hüdrolüüsima. Ülejäänud DNA ahel toimib matriitsina pöördtranskriptaasi (DNA polümeraasi) jaoks, et sünteesida komplementaarset teist DNA ahelat.

Saadud DNA kaksikheeliksit nimetatakse c-DNA-ks (komplementaarne DNA), see vastab geenile, millest mRNA loeti. Selline c-DNA sisestatakse baktereid transformeerivasse plasmiidi ja saadakse ainult valitud inimese geene sisaldavad kloonid.

L.V. Timoštšenko, M.V. Tšubik

Kõige tavalisem geenitehnoloogia meetod on rekombinantsete, st võõrgeeni sisaldavate plasmiidide saamise meetod.

Iga bakter võib lisaks põhilisele DNA molekulile (5-6 miljonit aluspaari), mis rakust ei lahku, sisaldada mitmeid erinevaid plasmiide, mida ta vahetab teiste bakteritega.

Plasmiidid on autonoomsed geneetilised elemendid, mis paljunevad (st paljunevad) bakterirakus erineval ajal kui peamine DNA molekul. Kuigi plasmiidid moodustavad vaid väikese osa raku DNA-st, kannavad nad bakteritele selliseid elutähtsaid geene nagu ravimiresistentsuse geenid. Erinevad plasmiidid sisaldavad erinevaid antibakteriaalsete ravimite resistentsuse geene.

Plasmiidvektorid luuakse reeglina geenitehnoloogia abil, kuna looduslikel (modifitseerimata) plasmiididel puudub hulk "kvaliteetse vektori" jaoks vajalikke omadusi:

Väikese suurusega, kuna E. coli eksogeense DNA ülekande efektiivsus väheneb plasmiidi pikkusega üle 15 tuhande aluspaari;

restriktsioonikoha olemasolu, millesse sisestati;

Ühe või mitme selektiivse geneetilise markeri olemasolu rekombinantset DNA-d kandvate retsipientrakkude tuvastamiseks.

Rekombinantse plasmiidi saamiseks lõigatakse ühe plasmiidi DNA valitud restriktsiooniensüümiga. Bakterirakku sisestatav geen lõigatakse restriktsiooniensüümi abil inimese kromosoomide DNA-st välja, seega on selle "kleepuvad" otsad komplementaarsed plasmiidide otstes olevate nukleotiidjärjestustega.

Mõlemad DNA tükid liimitakse kokku ensüümi ligaasiga, mille tulemuseks on rekombinantne ringplasmiid, mis sisestatakse E. coli bakterisse. Kõik selle bakteri järglased (kloonid) sisaldavad plasmiidides võõrgeeni. Kogu seda protsessi nimetatakse kloonimiseks.

Plasmiide ​​viiakse somaatilistesse rakkudesse keemiliste reaktiivide abil, mis suurendavad rakumembraani läbilaskvust. Plasmiidse DNA rakkudesse sisenemise võimaldamiseks töödeldakse neid jääkülma kaltsiumkloriidi lahusega ja hoitakse seejärel 1,5 minutit temperatuuril 42 °C. Selle ravi tulemuseks on rakuseina lokaalne kahjustus. Maksimaalne teisendussagedus on -10 -3, see tähendab, et iga tuhande raku kohta on üks transformatsioon. Transformatsioonikiirus ei ole kunagi 100%, siis kasutatakse transformeeritud rakkude tuvastamiseks selektsiooniskeeme.

Markeritena võib plasmiid sisaldada geene, mis määravad bakterite resistentsuse antibiootikumide suhtes. Võõr (doonor) geeni sisestamine markergeeni viib viimase inaktiveerimiseni. See võimaldab eristada transformeeritud rakke, mis said vektorplasmiidi (mis kaotas resistentsuse antibiootikumi suhtes) rakkudest, mis said rekombinantset molekuli (mis säilitas resistentsuse ühe, kuid kaotas resistentsuse teise antibiootikumi suhtes). Seda tehnikat nimetatakse sisestusmarkeri inaktiveerimiseks.

Rekombinantset DNA-d (hübriidplasmiidi) sisaldavate transformeeritud rakkude valimiseks viiakse läbi resistentsuse testimine teatud antibiootikumide suhtes. Näiteks hübriidplasmiidi kandvad rakud on resistentsed ampitsilliini suhtes, kuid tundlikud tetratsükliini suhtes (markergeen, millesse doonor-DNA sisestatakse).

Genoomse DNA kloonitud elementideks eraldamise ja nende elementide peremeesrakkudesse viimise protsessi nimetatakse genoomse raamatukogu (kloonipank, geenipank) loomiseks.

Kõik kloonimissüsteemid peavad vastama kahele põhinõudele:

1) mitme kloonimissaidi olemasolu;

2) rakkude üsna lihtsa identifitseerimise võimalus rekombinantse DNA-ga.

Kõigi tavapäraste molekulaarse kloonimise protseduuride puhul kasutatakse peremeesrakuna laialdaselt E. colit. Rakke, mis on võimelised absorbeerima võõr-DNA-d, nimetatakse kompetentseteks; E. coli pädevust suurendatakse kasutades eritingimused kasvatamine. Suure hulga võõrvalkude saamiseks rekombinantsete E. coli tüvede abil konstrueeriti plasmiid, mis sisaldas tugevat promootorit, selekteeritavat markergeeni ja lühikest lõiku mitme ainulaadse restriktsiooniensüümide saidiga – polülenker.

Efektiivne meetod E. coli transformeerimiseks plasmiididega on elektroporatsioon (rakumembraanide kokkupuude elektrivooluga, et suurendada nende läbilaskvust). Kloonitud geenide sisestamiseks somaatilistesse rakkudesse kasutatakse ka mikrosüste ja mikropunktsioone või DNA-ga laetud membraanvesiikulite (liposoomide) liitmist rakuga.

b mitmed erinevad plasmiidid, mida ta vahetab teiste bakteritega.

Plasmiidid on autonoomsed geneetilised elemendid, mis paljunevad (st paljunevad) bakterirakus erineval ajal kui peamine DNA molekul. Kuigi plasmiidid moodustavad vaid väikese osa raku DNA-st, kannavad nad bakteritele selliseid elutähtsaid geene nagu ravimiresistentsuse geenid. Erinevad plasmiidid sisaldavad erinevaid antibakteriaalsete ravimite resistentsuse geene.

Plasmiidvektorid luuakse reeglina geenitehnoloogia abil, kuna looduslikel (modifitseerimata) plasmiididel puuduvad mitmed kvaliteetse vektori jaoks vajalikud omadused:

Väikese suurusega, kuna E. coli eksogeense DNA ülekande efektiivsus väheneb plasmiidi pikkusega üle 15 tuhande aluspaari;

restriktsioonikoha olemasolu, millesse sisestati;

Ühe või mitme selektiivse geneetilise markeri olemasolu rekombinantset DNA-d kandvate retsipientrakkude tuvastamiseks.

Rekombinantse plasmiidi saamiseks lõigatakse ühe plasmiidi DNA valitud restriktsiooniensüümiga. Bakterirakku sisestatav geen lõigatakse restriktsiooniensüümi abil inimese kromosoomide DNA-st välja, mistõttu selle kleepuvad otsad on komplementaarsed plasmiidide otstes olevate nukleotiidjärjestustega.

Mõlemad DNA tükid liimitakse kokku ensüümi ligaasiga, mille tulemusena saadakse rekombinantne tsirkulaarne plasmiid, mis sisestatakse E. coli bakterisse. Kõik selle bakteri järglased (kloonid) sisaldavad plasmiidides võõrgeeni. Kogu seda protsessi nimetatakse kloonimiseks.

Plasmiide ​​viiakse somaatilistesse rakkudesse keemiliste reaktiivide abil, mis suurendavad rakumembraani läbilaskvust. Eelkõige plasmiidse DNA tungimise tagamiseks rakkudesse töödeldakse neid jääkülma kaltsiumkloriidi lahusega ja hoitakse seejärel 1,5 minutit temperatuuril 42 °C. Selle ravi tulemuseks on rakuseina lokaalne kahjustus. Maksimaalne teisendussagedus on -10-3, see tähendab, et iga tuhande raku kohta on üks transformeeritud rakk. Transformatsioonikiirus ei ole kunagi 100%, siis kasutatakse transformeeritud rakkude tuvastamiseks selektsiooniskeeme.

Markeritena võib plasmiid sisaldada geene, mis määravad bakterite resistentsuse antibiootikumide suhtes. Võõr (doonor) geeni sisestamine markergeeni viib viimase inaktiveerimiseni. See võimaldab eristada transformeeritud rakke, mis said vektorplasmiidi (mis kaotas resistentsuse antibiootikumi suhtes) rakkudest, mis said rekombinantset molekuli (mis säilitas resistentsuse ühe, kuid kaotas resistentsuse teise antibiootikumi suhtes). Seda tehnikat nimetatakse sisestusmarkeri inaktiveerimiseks.

Rekombinantset DNA-d (hübriidplasmiidi) sisaldavate transformeeritud rakkude valimiseks viiakse läbi resistentsuse testimine teatud antibiootikumide suhtes. Näiteks hübriidplasmiidi kandvad rakud on resistentsed ampitsilliini suhtes, kuid tundlikud tetratsükliini suhtes (markergeen, millesse doonor-DNA sisestatakse).

Genoomse DNA kloonitud elementideks eraldamise ja nende elementide peremeesrakkudesse viimise protsessi nimetatakse genoomse raamatukogu (kloonipank, geenipank) loomiseks.

Kõik kloonimissüsteemid peavad vastama kahele põhinõudele:

1. mitme kloonimissaidi olemasolu;
2. rakkude üsna lihtsa identifitseerimise võimalus rekombinantse DNA-ga.

Kõigi tavapäraste molekulaarse kloonimise protseduuride puhul kasutatakse peremeesrakuna laialdaselt E. colit. Rakke, mis on võimelised absorbeerima võõr-DNA-d, nimetatakse kompetentseteks; E. coli pädevust suurendatakse spetsiaalsete kultiveerimistingimuste abil. Et saada rekombinantseid E. coli tüvesid kasutades suurtes kogustes võõrvalke, konstrueeriti plasmiid, mis sisaldas tugevat promootorit, selekteeritavat markergeeni ja lühikest lõiku mitme ainulaadse saidiga polülenkeri restriktsiooniensüümide jaoks.

Efektiivne meetod E. coli transformeerimiseks plasmiididega on elektroporatsioon (rakumembraanide kokkupuude elektrivooluga, et suurendada nende läbilaskvust). Kloonitud geenide sisestamiseks somaatilistesse rakkudesse kasutatakse ka mikrosüste ja mikropunktsioone või DNA-ga laetud membraanvesiikulite (liposoomide) liitmist rakuga.

Järeldus

Liialdamata võib öelda, et biotehnoloogia minevik, olevik ja tulevik põhineb organismide geneetilisel mitmekesisusel, nii liikidevahelisel kui ka liigisisesel. Teaduse arengutaseme muutmine aitab ainult kaasa selle mitmekesisuse kvalitatiivselt uute kasutusviiside laienemisele ja tekkele.

Jah, intensiivne areng fundamentaaluuringud bioloogias tõi 20. sajandi teisel poolel kaasa olulisi edusamme sellistes bioloogiaharudes nagu molekulaarbioloogia ja geneetika, biokeemia ja ensümoloogia, neurofüsioloogia ja biofüüsika. Metoodika kasutamine täppisteadused(füüsika, keemia, matemaatika) võimaldas teadlastel iseloomustada erinevaid elutähtsaid protsesse molekulidevahelise interaktsiooni tasandil. DNA ja RNA struktuuri dešifreerimine, geneetilise teabe juurutamise protsess viis nn DNA-tehnoloogia väljatöötamiseni, mis võimaldas teadlasel töötada üksikute geenidega - geneetilise materjali spetsiifiliste osadega.

Selle tulemusena ilmus väga tõhus vahend geneetilise materjali eksperimentaalseks uurimiseks: selle organiseerimine, toimimine, interaktsioon. erinevaid elemente ja evolutsioon. Mitmete geneetiliselt enim uuritud organismide kohta oli võimalik saada piltlikult öeldes nende genoomi joonised.

Kui töötati välja üksikute geenide eraldamise tehnikad, valiti välja tingimused nende stabiilsuse säilitamiseks ja määrati kindlaks geeniülekande mustrid, tekkis reaalne võimalus rekombinantse DNA konstrueerimiseks (rekombinantse DNA loomine tähendab sõna otseses mõttes kahe DNA segmendi ühendamist (rekombineerimist). erinevad liigid). Tegelikult hakkas pärilik varieeruvus sihikindlalt kujunema inimese tahtel ja soovil ning organismid saadi sellise geenide (ja vastavalt ka tunnuste) kombinatsiooniga, mis looduses puuduvad.

Praegu on paljude spetsialistide jaoks biotehnoloogia ülesehitamise nurgakiviks geenitehnoloogia meetodid – rekombinantse DNA meetodid.

Geenitehnoloogia meetodite kasutamine hõlmab molekulaarsete geneetiliste süsteemide sihipärast ülesehitamist väljaspool keha koos järgneva elusorganismi viimisega.

Geenitehnoloogia metoodika kasutamine rakenduslikus aspektis hõlmab selliste rekombinantsete DNA molekulide kavandamist, mis geeniaparaati viides annaksid kehale inimesele kasulikud omadused.

Tänu sellele lahendatakse palju rakenduslikke probleeme: bioloogiliste reaktorite - inimesele farmakoloogiliselt olulisi valgupreparaate tootvate mikroorganismide, taimede ja loomade hankimine, teatud inimesele väärtuslike omadustega kõrge tootlikkusega loomatõugude loomine, erinevate patogeenide ja kahjurite suhtes resistentsete taimede aretamine. , ja nii edasi. Geneetiline sertifitseerimine, geneetiliste haiguste diagnostika, DNA vaktsiinide loomine ja erinevate haiguste ravi on seotud samade teadusmahukate tehnoloogiatega. Seega oli praegune soodne olukord bioloogias võimas tõuge kaasaegse biotehnoloogia arendamisel on väga oluline valdkond fundamentaalteaduste tulemuste praktilisel rakendamisel.

Bibliograafia

1. Atanasov A. Biotehnoloogia taimekasvatuses. Novosibirsk: ICGSO RAN, 1993. 241 lk.
2. Baranovov V.S. XXI sajandi geeniteraapia meditsiin // Sorose õppeajakiri. Nr 3. 1999. S. 3 68.
3. BekerM.E., LiepinshG.K., Raipulis E.P. Biotehnoloogia. M.: Agropromizdat, 1990. 334 lk.
4. Glebov OK Somaatiliste rakkude geneetiline transformatsioon // Rakkude kasvatamise meetodid. L.: Nauka, 1988.
5. GlikB., Pasternak J. Molekulaarne biotehnoloogia. Põhimõtted ja rakendus. M.: Mir, 2002.
6. EgorovNS, SamuilovVD Kaasaegsed meetodid mikroorganismide tööstuslike tüvede loomiseks // Biotehnoloogia. Raamat. 2. M.: lõpetanud kool, 1988. 208 lk.
7. Farmaatsia biotehnoloogia alused: õpik / T. P. Prishchep, V. S. Chuchalin, K. L. Zaykov, L. K. Mihhaleva. Rostov Doni ääres: Phoenix; Tomsk: NTL kirjastus, 2006.
8. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Agrobakterite plasmiidid ja taimede geenitehnoloogia. M.: Nauka, 1985. 280 lk.

Biotehnoloogia essee

"Rekombinantsed valgud (plasmiidide omadused, tootmine)"

Geenitehnoloogia on kasutatavate objektide omaduste poolest spetsiifilisem ja täpsem kui rakutehnoloogia ning toimib peamiselt erineva kuju ja suurusega rakufragmentidega. Mõisted "geenitehnoloogia", "geenitehnoloogia" ja "rekombinantne DNA" on samaväärsed.

Geenitehnoloogiat võib kujutada loodusliku ja sünteetilise päritoluga DNA fragmentide kombinatsioonina või nende kombinatsioonina in vitro koos saadud rekombinantsete struktuuride järgneva sisestamisega elav rakk nii et sisestatud DNA fragment pärast kromosoomi kaasamist kas replitseerub või ekspresseerub autonoomselt.

Geenitehnoloogia edusammud on viinud selleni, et enam kui 100 inimese valku (bioregulaatorid, homöostaasi korrektorid, kaasasündinud ja omandatud immuunsuse tegurid) suudavad säilitada oma videospetsiifilisuse. Neid toodetakse ravimitena mikrobioloogilise sünteesi teel. Samas võimaldab rekombinantne DNA tehnoloogia neid parandada: tõsta füsioloogilist aktiivsust, vähendada manustamisjärgsete kõrvaltoimete tõenäosust jne.

Peamine asi rekombinantsete valkude saamisel on lahendada toorainepuuduse probleem, kuna neid on inimkudedest tööstuslikus mastaabis võimatu kätte saada.

Inimese rekombinantsete valkude tootjatena kasutatakse praegu teistest sagedamini järgmisi: E. coli (E. coli), Bacillus subtilis (heinabatsill), Saccharomyces cerevisiae (pagaripärm).

Need organismid on üsna ohutud, kuid nende sattumine keskkonda on mitmel põhjusel ebasoovitav. Sellega seoses kehtivad rekombinantidega töötamise vastuvõetud ja hoolikalt järgitud reeglid.

Ohutust tuleb austada geneetilisel ja füüsilisel tasandil ning see kehtib kõigi rekombinantsete valkude tootmise kohta.

1. Geenitehnoloogia meetodid rekombinantsete valkude saamiseks

Geenitehnoloogia on funktsionaalselt aktiivsete geneetiliste struktuuride (rekombinantne DNA) in vitro konstrueerimine ehk teisisõnu kunstlike geneetiliste programmide loomine (Baev A.A.). Vastavalt E.S. Piruzyani geenitehnoloogia on eksperimentaalsete tehnikate süsteem, mis võimaldab laboris (katseklaasis) kujundada kunstlikke geneetilisi struktuure nn rekombinantsete või hübriidsete DNA molekulide kujul.

Geenitehnoloogia on uute geneetilise materjali kombinatsioonide tootmine, manipuleerides nukleiinhappemolekulidega väljaspool rakku ja kandes üle loodud geenikonstruktsioonid elusorganismile, mille tulemuseks on nende kaasamine ja aktiivsus selles organismis ja selle järglastes. Me räägime suunatud, etteantud programmi järgi molekulaarsete geneetiliste süsteemide ülesehitamisest väljaspool keha koos nende hilisema sissetoomisega elusorganismi. Sel juhul muutub rekombinantne DNA lahutamatu osa retsipientorganismi geneetiline aparaat ja anda sellele uued ainulaadsed geneetilised, biokeemilised ja seejärel füsioloogilised omadused.

Rakendusliku geenitehnoloogia eesmärk on kujundada sellised rekombinantsed DNA molekulid, mis geeniaparaati viides annaksid kehale inimesele kasulikud omadused. Näiteks "bioloogiliste reaktorite" saamine – inimesele farmakoloogiliselt olulisi aineid tootvad mikroorganismid, taimed ja loomad, teatud inimesele väärtuslike tunnustega taimesortide ja loomatõugude loomine. Geenitehnoloogia meetodid võimaldavad läbi viia geneetilist sertifitseerimist, diagnoosida geneetilisi haigusi, luua DNA vaktsiine ja läbi viia erinevate haiguste geeniteraapiat.

Rekombinantne DNA tehnoloogia kasutab järgmisi meetodeid:

DNA spetsiifiline lõhustamine restriktsiooninukleaaside abil, kiirendades üksikute geenide eraldamist ja manipuleerimist;

Puhastatud DNA fragmendi kõigi nukleotiidide kiire järjestamine, mis võimaldab määrata geeni ja selle poolt kodeeritud aminohappejärjestuse piirid;

Rekombinantse DNA konstrueerimine;

Nukleiinhapete hübridisatsioon, mis võimaldab tuvastada spetsiifilisi RNA või DNA järjestusi suurema täpsuse ja tundlikkusega, lähtudes nende võimest siduda komplementaarseid nukleiinhappejärjestusi;

DNA kloonimine: in vitro amplifikatsioon polümeraasi ahelreaktsiooniga või DNA fragmendi sisestamine bakterirakku, mis pärast sellist transformatsiooni reprodutseerib seda fragmenti miljonites koopiates;

Rekombinantse DNA sisestamine rakkudesse või organismidesse.

Rekombinantsete molekulide konstrueerimine toimub mitmete ensüümide, peamiselt restriktsiooniensüümide abil. Praegu on kasutusel üle 400 erineva piirangu. Need ensüümid sünteesivad väga erinevaid mikroorganisme.

Restriktsiooniensüümid tunnevad ära ja lõikavad kaheahelalises DNA molekulis ära spetsiifilised nukleotiidjärjestused. Molekulaarseks kloonimiseks aga restriktsiooniensüümidest üksi ei piisa, sest vesiniksidemed nelja aluse vahel, mis moodustavad kleepuvad otsad, ei ole piisavalt tugevad, et kahte kombineeritud DNA fragmenti kinni hoida.

Rekombinantse DNA molekuli üks osa kannab soovitud geeni, mis peaks olema kloonitud, teine ​​aga sisaldab teavet, mis on vajalik rekombinantse DNA replikatsiooniks rakus.

Levinuim geenitehnoloogia meetod on rekombinantsete (võõrgeeni sisaldavate) plasmiidide hankimise meetod, mis on ringikujulised kaheahelalised DNA molekulid, mis koosnevad mitmest nukleotiidipaarist ja on autonoomsed.

Plasmiide ​​iseloomustab stabiilne olemasolu mittekromosomaalses olekus bakterites. Iga bakter võib lisaks põhilisele DNA molekulile (5 * 106 aluspaari), mis rakust ei lahku, sisaldada mitut erinevat plasmiidi, mida ta vahetab teiste bakteritega.

Plasmiidid, mille suurused varieeruvad mitmest tuhandest kuni sadade tuhandete aluspaarideni ja koopiate arv raku kohta ühest kuni mitmesajani, on võimelised autonoomseks (peamisest kromosoomist sõltumatuks) replikatsiooniks ja on stabiilselt päritud mitmetes raku põlvkonnad.

Kuigi paljud plasmiidid annavad peremeesrakkudele käegakatsutavaid selektiivseid eeliseid (antibiootikumiresistentsus, raskemetallid jne), enamik neist on, st ei avaldu rakkude fenotüübis.

Liialdamata võib öelda, et biotehnoloogia minevik, olevik ja tulevik põhineb organismide geneetilisel mitmekesisusel, nii liikidevahelisel kui ka liigisisesel. Teaduse arengutaseme muutmine aitab ainult kaasa selle mitmekesisuse kvalitatiivselt uute kasutusviiside laienemisele ja tekkele.

Seega viis bioloogia fundamentaaluuringute intensiivne areng 20. sajandi teisel poolel märkimisväärse eduni sellistes bioloogiaharudes nagu molekulaarbioloogia ja geneetika, biokeemia ja ensümoloogia, neurofüsioloogia ja biofüüsika. Täppisteaduse metoodika (füüsika, keemia, matemaatika) kasutamine võimaldas teadlastel iseloomustada erinevaid elutähtsaid protsesse molekulidevahelise interaktsiooni tasandil. DNA ja RNA struktuuri dešifreerimine, geneetilise teabe juurutamise protsess viis nn DNA-tehnoloogia väljatöötamiseni, mis võimaldas teadlasel töötada üksikute geenidega - geneetilise materjali spetsiifiliste osadega.

Selle tulemusena on ilmunud väga tõhus vahend geneetilise materjali eksperimentaalseks uurimiseks: selle organiseerimine, toimimine, erinevate elementide koostoime ja evolutsioon. Mitmete geneetiliselt enim uuritud organismide puhul oli võimalik saada piltlikult öeldes "joonised" nende genoomist.

Kui töötati välja üksikute geenide eraldamise tehnikad, valiti välja tingimused nende stabiilsuse säilitamiseks ja määrati kindlaks geeniülekande mustrid, tekkis reaalne võimalus rekombinantse DNA konstrueerimiseks (rekombinantse DNA loomine tähendab sõna otseses mõttes kahe DNA segmendi ühendamist (rekombineerimist). erinevad liigid). Tegelikult hakkas pärilik varieeruvus sihikindlalt kujunema inimese tahtel ja soovil ning organismid saadi sellise geenide (ja vastavalt ka tunnuste) kombinatsiooniga, mis looduses puuduvad.

Praegu on paljude spetsialistide jaoks biotehnoloogia ülesehitamise nurgakiviks geenitehnoloogia meetodid – rekombinantse DNA meetodid.

Geenitehnoloogia meetodite kasutamine hõlmab molekulaarsete geneetiliste süsteemide sihipärast ülesehitamist väljaspool keha koos järgneva elusorganismi viimisega.

Geenitehnoloogia metoodika kasutamine rakenduslikus aspektis hõlmab selliste rekombinantsete DNA molekulide kavandamist, mis geeniaparaati viides annaksid kehale inimesele kasulikud omadused.

Tänu sellele lahendatakse palju rakenduslikke probleeme: "bioloogiliste reaktorite" saamine - mikroorganismid, taimed ja loomad, mis toodavad inimesele farmakoloogiliselt olulisi valgupreparaate, kõrge tootlikkusega loomatõugude loomine teatud inimesele väärtuslike tunnustega, taimede aretamine, mis on resistentsed inimesele. mitmesugused patogeenid ja kahjurid ja nii edasi. Geneetiline sertifitseerimine, geneetiliste haiguste diagnostika, DNA vaktsiinide loomine ja erinevate haiguste ravi on seotud samade teadusmahukate tehnoloogiatega. Seega oli praegune soodne olukord bioloogias võimsaks tõukejõuks tänapäevase biotehnoloogia, väga olulise fundamentaalteaduste tulemuste praktilise rakendusvaldkonna, arengule.

1. Atanasov A. Biotehnoloogia taimekasvatuses. Novosibirsk: ICGSO RAN, 1993. - 241 lk.

2. Baranov V.S. Geeniteraapia - XXI sajandi meditsiin // Sorose haridusajakiri. Nr 3. 1999. S. 3 - 68.

3. Beker M.E., Liepinsh G.K., Raipulis E.P. Biotehnoloogia. M.: Agropromizdat, 1990. 334 lk.

4. Glebov O.K. Somaatiliste rakkude geneetiline transformatsioon // Rakkude kasvatamise meetodid. L.: Nauka, 1988.

5. Glick B., Pasternak J. Molekulaarne biotehnoloogia. Põhimõtted ja rakendus. M.: Mir, 2002.

6. Egorov N.S., Samuilov V.D. Kaasaegsed meetodid mikroorganismide tööstuslike tüvede loomiseks // Biotehnoloogia. Raamat. 2. M.: Kõrgkool, 1988. 208 lk.

7. Farmaatsia biotehnoloogia alused: õpik / T.P. Prištšep, V.S. Tšuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mihhalev. - Rostov Doni ääres: Phoenix; Tomsk: NTL kirjastus, 2006.

8. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Agrobakterite plasmiidid ja taimede geenitehnoloogia. M.: Nauka, 1985. 280 lk.

Patendi RU 2422525 omanikud:

Leiutis käsitleb geenitehnoloogiat, biokeemiat, biotehnoloogiat ja immunoloogiat. Kirjeldatud on rekombinantset plasmiidi pESAT6-CBD, mis koosneb tehislikust bakteriaalsest kimäärse valgu operonist, sealhulgas varase bakteriofaagi T5 promootori promootorpiirkonnast, kimäärsest valgugeenist ja transkriptsiooni terminaatorist; bakteriaalne beeta-laktamaasi operon ja ColE1 tüüpi bakteriaalne replikatsiooni alguspunkt. Leiutis hõlmab ka Escherichia coli tüve – kimäärse valgu ESAT6-CBD tootjaid, samuti meetodit saadud valgu immobiliseerimiseks, kontsentreerimiseks ja puhastamiseks tselluloosil. Lisaks käsitleb leiutis rekombinantset ESAT6-CBD valku ennast ja seda sisaldavat immunogeenset kompositsiooni, mille eesmärk on esile kutsuda immuunsus tuberkuloosiinfektsiooni vastu. MÕJU: leiutis võimaldab saada tootjatüve, mis tagab stabiilsete immunogeensete valkude kõrge tootmistaseme, mida on võimalik saada, immobiliseerida ja puhastada ühes etapis, samuti saada tõhusaid immunogeenseid koostisi tuberkuloosi vastu. 6 n.p. f-ly, 1 ill., 1 tab.

Leiutis käsitleb geenitehnoloogiat, biokeemiat, biotehnoloogiat ja immunoloogiat.

Praegu on maailmas ainus kasutatav tuberkuloosivastane vaktsiin BCG (BCG, Bacillus Calmette-Guerin, 1921), mis on Mycobacterium bovis'e nõrgestatud elustüvi. See on ohutu, odav ja üsna tõhus laste kaitsmisel nii tuberkuloosi nakkuse kui ka miliaarse tuberkuloosi ja tuberkuloosi meningiidi eest. BCG ei kaitse aga täiskasvanuid kopsutuberkuloosi eest ning just see haigusvorm põhjustab nakkuse leviku ja tõsise epideemia olukorra. Sellest tuleneb uute tuberkuloosivastaste vaktsiinide väljatöötamise kiireloomulisus.

BCG-le alternatiivsete uute tuberkuloosivaktsiinide väljatöötamiseks on mitu suunda: subühikuvaktsiinid, DNA-vaktsiinid ja täiustatud omadustega elusvaktsiinid. Subühikvaktsiinid, sealhulgas preparaadid, mis koosnevad mitmest Mycobacterium tuberculosis'e sekreteeritud valkudest/peptiididest (Doherty Т.М., Olsen A.W., Weischenfeldt I. J. jt. Erinevate vaktsiinikonstruktsioonide võrdlev analüüs, mis ekspresseerivad määratud antigeene Mycobacterium tuberculosis'est, The Journal of Infectious Diseas 2004, 190. kd, lk 2146-2153). On tuvastatud palju M. tuberculosis'e antigeene, mis on potentsiaalselt olulised uute vaktsiinide komponentidena. Nende hulka kuuluvad eelkõige immunodominantsed sekreteeritud antigeenid, mis esinevad M. tuberculosis'e kultuurifiltraadis. M. tuberculosis'e sekreteeritavatest antigeenidest on kõige paremini uuritud antigeenid ESAT-6 (Early Secret Antigen Target-6), CFP-10 (kultuuri-filtraadi valk-10) ja kompleks 85 valgud (Ag85A, B, C).

ESAT-6 ja CFP-10 valgud transleeritakse osana samast lugemisraamist RD1, mis esineb erinevates virulentsete mükobakterite tüvedes, kuid on kadunud BCG vaktsiinitüves. Nii looduslikud kui ka rekombinantsed ESAT-6 ja CFP-10 valgud kutsuvad esile gamma-interferooni (IFN-gamma, IFN-y) sünteesi M. tuberculosis'ega (Johnson P.D., Stuart R.L., Grayson) nakatunud isikute perifeerse vere T-lümfotsüütide poolt. jt Tuberkuliiniga puhastatud valgu derivaatide, MPT-64 ja ESAT-6-stimuleeritud gamma-interferooni vastused meditsiiniüliõpilastel enne ja pärast Mycobacterium bovis BCG vaktsineerimist ning tuberkuloosihaigetel. Clin. Diagn. Lab. Immunol, 1999, Vol. .6, nr 6, lk 934–937, Berthet F. X., Rasmussen P. B., Rosenkrands I. jt. Mycobacterium tuberculosis operon, mis kodeerib ESAT-6 ja uudset madala molekulmassiga kultuuri filtraatvalku (CFP-10). 1998, Vol. 144, No. 11, pp. 3195-3203), nii et mõlemat valku kasutatakse arendamiseks erinevaid teste tuberkuloosi seroloogiline diagnoos (Arend S.M., Andersen P., van Meijgaarden K.E. jt. Aktiivse tuberkuloosiinfektsiooni tuvastamine T-rakkude vastuste järgi varakult sekreteeritud antigeense sihtmärk 6-kDa valgu ja kultuuri filtraatvalgu suhtes 10. J. Infect. Dis., 2000 van Pinxteren L.A., Ravn P., Agger E.M. et al. Tuberculosis Diagnoos põhineb kahel spetsiifilisel antigeenil ESAT-6 ja CFP10. Clin. Diagn. Lab., Vol.181, No. 5, pp.1850-1854. Immunol., 2000, 7. kd, nr 2, lk 155-160).

Leiutise eesmärgiks on välja töötada üksikutel valgukomponentidel põhinev vaktsiinipreparaat, millel on kõrge ekspressioonitase ja nende valkude stabiilsus bakterisüsteemis, tõhus süsteem puhastamine ja immunogeensuse testimise lihtsus.

Selle probleemi lahendamiseks kasutatakse kimäärse valgu konstrueerimist, kombineerides ühte translatsiooniraami kahte geeni – vaktsineeriva valgu geeni ja kandevalgu geeni, mis viib kimäärse valgu sünteesini bakterisüsteemis. Loodi rekombinantne valk, mis koosnes kahest komponendist: M. tuberculosis antigeenist ja termofiilse mikroorganismi Anaerocellum thermophilum (CBD) tselluloosi siduvast domeenist CelD. CBD-d sisaldavat rekombinantset valku saab ühes etapis immobiliseerida tselluloosi kandjale. Tulemuseks on samaaegne puhastamine, kontsentreerimine ja stabiliseerimine, samuti kaitse bakterite tootjate proteaaside eest. Samal ajal ei rikuta funktsionaalselt aktiivse valgu domeeni algseid antigeenseid omadusi.

Seda lähenemisviisi kasutades saadi kahekomponendiline rekombinantne valk. M. tuberculosis esat6 geenijärjestus kodeerib täispikka valku, mis moodustab esimese valgudomeeni, mis määrab kompleksmolekuli funktsionaalsed immunoloogilised omadused. Sellele järgneb mitmest vahelduvast glütsiini ja seriini jäägist (Gly-Ser) koosnev ühendav (vahe)aminohappejärjestus. Teist valgu domeeni kodeerib A. thermophilum CelD endoglükonaasi geenijärjestus; see määrab toote võime suhelda tselluloosi sorbendiga. Valgutooteid toodetakse mittepatogeensetes Escherichia coli laboratoorsetes tüvedes. Tselluloosile immobiliseeritud antigeen on sorbendi suspensioon, millele on adsorbeeritud valk. Tselluloosi kandja toimib immuniseerimisel adjuvandina, mis tagab antigeeni suurenemise, polümerisatsiooni, ilma milleta tekib nõrgem immuunvastus valgu monoantigeenile. Vabas olekus antigeenid on teatud ioontugevusega lahused, mis ei sisalda lipopolüsahhariidide ja tootjatüve DNA segusid.

Oluliseks probleemiks on lõpptoodete puhastamine organismile väga mürgistest lipopolüsahhariididest, ballastvalkudest, tootjatüvede DNA-st ja RNA-st.

Seega võimaldab väidetav leiutiste rühm luua E. coli tüve, mis tagab M. tuberculosis ESAT6 valku sisaldava rekombinantse valgu kõrge tootmistaseme; saada lihtne ja tõhus skeem rekombinantse valgu puhastamiseks, mis spetsiifiliselt ja tõhusalt kutsub esile immuunvastuse mükobakterite antigeenidele, sealhulgas IFN-gamma sünteesi, mis on vajalik tuberkuloosivastaseks kaitseks; luua tselluloosi kandjal (adjuvandil) rekombinantsel valgul põhinev immunogeenne kompositsioon.

See tulemus saavutati tänu rekombinantse ESAT6-CBD valgu sünteesile rekombinantse tüve E. coli M15 rakkudes, mis kannavad rekombinantset plasmiidi pESAT6-CBD. Samuti luues komplekspreparaadi ESAT6-CBD-tselluloos, milles rekombinantne valk ESAT6-CBD rekombinantne valk (kontsentratsioon 2,1 mg/ml) immobiliseeritakse tselluloosile (2,8 massiprotsenti preparaadis) ja resuspendeeritakse 1x PBS pH puhvris 7,2. -7.4.

Leiutise olemus seisneb selles, et taotluses sisalduv plasmiid sisaldab järgmisi funktsioneerimiseks vajalikke struktuurielemente:

a) kimäärsete valkude kunstlik bakteriaalne operon, mis koosneb:

Bakteriofaagi T5 varase promootori (7-87 aluspaari) promootorpiirkond, mis tagab mRNA tõhusa transkriptsiooni;

Kimäärset valku kodeeriv rekombinantne geen "M. tuberculosis ESAT6 valgujärjestus - speisser - A. thermophilum tselluloosi siduv domeen" - ESAT6-CBD (117-1007 bp);

Bakterioperoni transleerimata transkriptsiooni terminatsioonipiirkond, mis tagab tõhusa transkriptsiooni terminatsiooni pESAT6-CBD (1041-1147 bp);

b) bakteriaalne operon bla, mis kodeerib valgu beeta-laktamaasi, mis on selektiivne marker komplementaarse ahela E. coli tüve pESAT6-CBD (3217-4067 bp) transformeerimiseks.

c) ColE1 tüüpi bakteriaalse replikatsiooni initsiatsioonikoht, mis tagab plasmiidi replikatsiooni E. coli tüves pESAT6-CBD (2474-2485 bp).

Nii loodi rekombinantne plasmiid pESAT6-CBD (4282 bp), mis kodeerib bifunktsionaalset rekombinantset valku ESAT6-CBD, millel on võime spontaanselt seonduda tselluloosi sisaldava sorbendiga. Plasmiid sisaldab järgmisi struktuurielemente: kimäärse valgu kunstlik bakteriaalne operon, sealhulgas bakteriofaagi T5 varase promootori promootorpiirkond (80 aluspaari), kimäärse valgu ESAT6-CBD geen (890 aluspaari) ja transkriptsioon. terminaator (94 bp) ; bakteriaalne beeta-laktamaasi operon (860 aluspaari) ja ColE1 tüüpi bakterite replikatsiooni initsiatsioonikoht (11 aluspaari). Rekombinantse ESAT6-CBD valgu tüve tootja saadakse E. coli tüve M15 rakkude transformeerimisel pESAT6-CBD plasmiidiga. Tüvi tagab rekombinantse ESAT6-CBD valgu tootmise pärast induktsiooniprotseduuri (isopropüül-β-D-tio-galaktopüranosiid) (IPTG) kuni 12-15% kogu rakuvalgust.

E. coli M15 tüve, mis kannab pESAT6-CBD plasmiidi, mis on bifunktsionaalse rekombinantse ESAT6-CBD valgu tootja, iseloomustavad järgmised tunnused.

Kultuurilised ja morfoloogilised tunnused. Rakud on sirged, vardakujulised, liikumatud, gramnegatiivsed. Kui külvatakse 2,0% agarisöötmega plaadile, kasvab LB üksikute kolooniate kujul, mõnikord sakiliste servadega R-kujuline. Kasvab hästi tihedal ja vedelal pinnal toitainekeskkond(LB-puljong, LB-agar, MPA, MPB).

Füsioloogilised ja biokeemilised tunnused. Rakud kasvavad temperatuuril +4°C kuni +42°C, optimaalsel pH=6,8-7,5. Tüvi lagundab glükoosi, mannitooli happe moodustumisega, ei lagunda sahharoosi, arabinoosi, galaktoosi, fermenteerib maltoosi, ksüloosi, sorbitooli, ramnoosi. Nende tüvede kasutamisel on oluline tundlikkus nalidiksiinhappe (25 mg/ml), streptomütsiini (20 mg/ml) ja rifampitsiini (25 mg/ml) suhtes. Näitab resistentsust ampitsilliini (kuni 300 μg/ml) suhtes pESAT6-CBD plasmiidi olemasolu tõttu ja kanamütsiini suhtes (kuni 50 μg/ml) pREP4 plasmiidi olemasolu tõttu.

Rekombinantse valgu ja amorfse tselluloosi komplekspreparaadi loomiseks saavutatakse tehniline tulemus kahekomponendilise rekombinantse valgu loomisega, mis koosneb M. tuberculosis'e ESAT6 valgust ja A. thermophilum'i CelD endoglükonaasi geenist. Ja ka komplekspreparaadi (immunoloogilise koostise) saamine, milles rekombinantne valk (Ag-CBD) immolüüsitakse amorfsel tselluloosil (Ag-CBD-tselluloos).

Rekombinantne ESAT6-CBD valk sisaldab domeeni, mis määrab selle võime seostuda tselluloosiga, mis võimaldab kontsentreerida, puhastada ja immobiliseerida valguprodukti tselluloosil ühes etapis. Immobiliseerimine tselluloosile on tagatud tänu termofiilse mikroorganismi A. thermophilum CelD endoglükonaasi tselluloosi siduva domeeni rekombinantses valguses, millel on kõrge afiinsus kristalse ja amorfse tselluloosi suhtes ning mis tagab pöördumatu seondumise kandjaga laialdaselt. pH vahemik = 4-11, temperatuurid: 0 kuni +75°C ja NaCl kontsentratsioonid: 0 kuni 5 M.

Kuna E. coli-s puuduvad tselluloosiga seonduvad valgud, on pESAT6-CBD plasmiidiga transformeeritud E. coli rakkudes sünteesitud rekombinantne ESAT6-CBD valk ainus tootjatüve valk, mis seostub tugevalt tselluloosiga. See võimaldab saada ühe etapiga sorbendile immobiliseeritud kõrge puhtusega valgupreparaati. Joonisel on kujutatud plasmiidi pESAT6-CBD diagramm.

Komplekspreparaadi ESAT6-CBD - tselluloosi immunogeensust uuriti hiirtel kahel meetodil. Esiteks immuniseeriti hiired tagakäpapadjandites ja 18 päeva pärast võrreldi T-rakkude proliferatsioonivastust ainult CBD-tselluloosiga immuniseeritud hiirte omaga. Ilmnes väljendunud spetsiifiline immuunvastus kõigile kolmele antigeenile koos proliferatsiooniindeksite kogemusega: kontroll = 5-7. Teise skeemi kohaselt immuniseeriti hiiri seljanaha all 2 korda 2-nädalase intervalliga immunogeense ja kontrollpreparaadiga. 5 nädala pärast uuriti T-rakkude proliferatiivset vastust ja gamma-IFN-i tootvate T-rakkude arvu. Võrreldes kontrollloomadega tuvastati IFN-gamma-positiivsete T-rakkude arvu 2-3-kordne suurenemine ja 4-6-kordne proliferatsiooni suurenemine vastavate antigeenide juuresolekul rakukultuuris.

Uuritud preparaatide kaitsva toime testimiseks nakatati ESAT-6 antigeeni suhtes immuunsed loomad (immuniseerimine ESAT-6-CBD-tselluloosiga), samuti kontrollloomad (immuniseerimine CBD-tselluloosi ja soolalahusega) veeni virulentse ainega. tüvi M. tuberculosis H37Rv annuses 5 × 10 6 cfu/hiir. 3 nädalat pärast nakatamist surmati igast rühmast 4 hiirt ja elundite homogenaadid kanti Dubose agariga Petri tassidele. ESAT-6 suhtes immuunsete hiirte kopsudes ja põrnas täheldati kontrollloomadega võrreldes 7-kordset bakterikoormuse vähenemist.

Leiutise rakendamisel saavutatud tehniline tulemus on tootjatüve tootmine, mis tagab stabiilse immunogeense valgu kõrge tootmistaseme, mida on võimalik saada, immobiliseerida ja puhastada ühes etapis. On saadud tõhus tuberkuloosivastane immunogeenne koostis.

Leiutist illustreerivad järgmised allpool toodud näited. Geenitehnoloogia ja mikrobioloogilised manipulatsioonid, DNA amplifikatsioon ja sekveneerimine viidi läbi standardsete meetoditega (T. Parish, N. G. Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Maniatis T., Fritsch E. ., Sambrook J. Molecular cloning, M.: Mir, 1984; DNA kloonimine. Methods. Toimetanud D. Glover, tõlgitud inglise keelest, Moskva, Mir, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al., Primer Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sekveneerimine ahelat lõpetavate inhibiitoritega (DNA polümeraas/nukleotiidjärjestused/bakteriofaag 4X174) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74. kd, nr 12, lk 5463-5467 ).

Näide 1. Plasmiidi saamine.

a) M. tuberculosis valgu geeni fragmendi saamine koos järgneva kloonimisega.

Saadi ESAT-6 valgu geeni fragment PCR meetod. Amplifikatsiooni matriitsina kasutati M. tuberculosis'e kromosomaalset DNA-d. Sihtgeenifragmendi sünteesiks kavandati spetsiifilised praimerid (CJSC Syntol, RF), mille järjestusse viidi kloonimiseks ka restriktsiooniendonukleaaside BamHI, BspMII (Kpn2I) ja NcoI (paks, alla joonitud) saidid. translatsiooni initsiatsiooni- ja lõpetamiskoodonitena (kaldkiri).

PCR-i töösegule lisati 2,5 mM iga praimerit, reaktsioon viidi läbi järgmistes tingimustes: a) 95 °C 10 minutit; b) 94 °C 4,5 min, 60 °C 5 min, 72 °C 40 s; c) 94 °C 2 min, 65 °C 1 min, 72 °C 40 s, 94 °C 1 min - 30 tsüklit; d) 65°С 5 min; e) 72°С 10 min; f) 10°C – säilitamine. Kaheahelaliste DNA fragmentide kloonimiseks lõigati plasmiidvektor pQE6 restriktsiooni endonukleaasidega NcoI ja Kpn2I temperatuuril 37 °C puhvris, mis sisaldas 33 mM Tris-atsetaati (pH 7,9 temperatuuril 37 °C), 10 mM magneesiumatsetaati, 66 mM kaaliumit. atsetaat ja 0 1 mg/ml BSA 1 tund Restriktsiooniproduktid eraldati 1,2% agaroosgeelis. Agaroosgeelist eraldatud pQE6 vektori fragment (3016 aluspaari suurune) kombineeriti cfp10 (293 aluspaari) ja esat6 (305 aluspaari) fragmentidega. Ligeeriti temperatuuril 25 °C puhvris, mis sisaldas 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (pH 7,8 temperatuuril 37 °C), kasutades bakteriofaagi T4 DNA ligaasi 1 tund. Reaktsiooniproduktid sadestati uuesti -20 °C 96% C 2H 5OH ammooniumatsetaadi lisamisega 1,5 tundi Pärast uuesti sadestamist lahustati segu deioniseeritud vees (mQ H20). E. coli tüve M15 (Nal S, Str S, rif S, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+) kompetentsed rakud transformeeriti elektroporatsiooni teel saadud ligeerimissegudega. Pärast transformatsiooni selekteeriti kloonid LB agarisöötmel, mis sisaldas antibiootikume ampitsilliini (50 mg/ml) ja kanamütsiini (25 mg/ml). Kolooniate plasmiidne DNA eraldati aluselise lüüsiga; analüüsiti restriktsioonikaardistamise teel restriktsiooni endonukleaasidega BglI, BglII, BspMII, NcoI. Valiti välja tuberkuloosse valgu järjestust sisaldava plasmiidse DNA pESAT6 (3309 bp) kloonid. Saadud konstruktide esmane struktuur kinnitati sekveneerimisega.

b) plasmiidi saamine, mis sisaldab mükobakteri valgu geeni järjestust, Gly-Ser speisserit ja CBD tselluloosi siduvat domeeni.

M. tuberculosis ESAT6 valgu geenijärjestust, Gly-Ser speisserit ja CBD tselluloosi siduvat domeeni kodeeriva konstrukti saamiseks lõigati pESAT6 plasmiid restriktsiooniendonukleaasidega BglII, PvuI, XbaI temperatuuril 37 °C puhvris, mis sisaldas 50 ug. mM Tris-HCl (pH 7, 5), 10 mM magneesiumkloriid, 100 mM naatriumkloriid ja 0,1 mg/ml BSA 1 tund. Plasmiid pspCBD (ptt10), mis kodeerib Gly-Ser järjestust ja tselluloosi siduvat domeeni, lõigati restriktsiooni endonukleaasidega BamHI ja BglI temperatuuril 37 °C puhvris, mis sisaldas 66 mM Tris-atsetaati (pH 7,9 temperatuuril 37 °C), 20 °C. mM magneesiumatsetaati, 132 mM kaaliumatsetaati ja 0,2 mg/ml BSA-d 1 tund. Restriktsiooniproduktid eraldati 1,2% agaroosgeelis. Agaroosgeelist eraldatud plasmiidse DNA pESAT6 (2696 bp) ja pspCBD (2414 aluspaari) restriktsioonifragmendid ligeeriti bakteriofaagi T4 DNA ligaasiga. Pädevad E. coli M15 rakud transformeeriti, kasutades saadud ligeerimissegusid elektroporatsiooni teel. Pärast transformatsiooni selekteeriti kloonid LB agarisöötmel, mis sisaldas antibiootikume ampitsilliini ja kanamütsiini. Plasmiidne DNA eraldati aluselise lüüsiga, analüüsiti restriktsioonikaardistamise teel restriktsiooni endonukleaasidega BamHI, BglI, BgLII, NcoI, PvuI. Valiti välja plasmiidse DNA pESAT6-CBD (4282 bp) kloonid, mis sisaldasid tuberkuloosivalgu järjestust, Gly-Ser speisserit ja CBD tselluloosi siduvat domeeni. Saadud konstruktide esmane struktuur kinnitati sekveneerimisega.

Näide 2. E. coli tüve konstrueerimine, mis toodab M. tuberculosis'e antigeeni, mis on seotud tselluloosi siduva domeeniga.

Rekombinantset ESAT6-CBD valku tootva E. coli tüve saamiseks transformeeriti E. coli M15 tüve rakud pESAT6-CBD plasmiidiga. Transformeeritud rakke kasvatati 3,5 ml LB söötmes ampitsilliini ja kanamütsiiniga temperatuuril 37 °C kuni optilise tiheduseni 1 ühik. neeldumine lainepikkusel 550 nm (umbes 2,5 h). Kultuurile lisati 3 μl 0,1 M isopropüül-beeta-D-tiogalaktopüranosiidi (IPTG, IPTG) lahust ja kasvatati 3 tundi Rekombinantsete valkude tootmise kontrollimiseks E. coli M15, E. coli M15 tüvedes, kasutati Laemmli elektroforeesi meetodit naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul. Valkude eraldamine viidi läbi 12% polüakrüülamiidgeelil (PAGE) standardses puhversüsteemis (elektroodipuhver: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glütsiin, 0,1% naatriumdodetsüülsulfaat, pH 8,3; geelipuhver: 375 mM Tris-HCl, pH 8,8). Elektroforeesi lõpus värviti geelid 0,15% Coomassie G250-ga 25% isopropanoolis ja 10% äädikhappes ning pesti 10% äädikhappes.

E. coli M15 ja E. coli M15 tüvede valkude spektri võrdlus näitas täiendava valguriba ilmnemist. Molekulmass täiendav riba 32,0 kDa vastas ESAT6-CBD valgu arvutatud ribale. Valgusünteesi tase E. coli-s määrati, võrreldes rekombinantse valgu riba värvumise intensiivsust vastava valgustandardi Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas, Leedu) ribaga.

Sünteesitud valgu lahustuvuse testimiseks hävitati kasvatatud tüve (E. coli M15) biomass 1% TES puhvris (25 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% Triton X-). 100, 5 mg/ml lüsosüümi) biomassi-puhvri vahekorras 1:2 ja homogeniseeritakse homogeenseks massiks. Pärast tsentrifuugimist jagati proovid kaheks fraktsiooniks: lahustuvad rakuvalgud (settevedelik) ja lahustumatud (sade). Mõlemad fraktsioonid hävitati lüüsipuhvris (0,05 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,5% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 0,25 M MgCl2, 5 mg/ml lüsosüüm, 10 mg/ml ml PMSF, 20 mg /ml DNaasi) vahekorras 1:1; homogeniseeritud homogeenseks massiks; kuumutatakse +95°С juures 15 min. Tulemusi jälgiti Laemmli elektroforeesiga. Näidati, et rekombinantne ESAT6-CBD valk sünteesitakse E. coli rakkudes nii lahustuva fraktsioonina kui ka inklusioonkehade kujul.

Näide 3. Rekombinantse valgu ESAT6-CBD saamine vabas olekus ja immobiliseeritud tselluloosile.

Rekombinantse valgu saamiseks kasvatati E. coli M15 tüve kultuuri 1000 ml LB söötmes ampitsilliini ja kanamütsiiniga temperatuuril 37 °C optilise tiheduseni, mis vastas 1 ühikule. neeldumine lainepikkusel 550 nm. Söötmele lisati 100 μl 0,1 M IPTG lahust ja kasvatati 3 h. Rakud sadestati tsentrifuugimisega kiirusel 5500 p/min 15 minutit.

Pellet resuspendeeriti lüüsipuhvris, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,25 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,15 mM PMSF, 0,1% Triton-X100, 0,5 mg/mL lüsosüümi 20 mg/ml; kiirusega 1 g biomassi 4 ml puhvri kohta. Lisaks töödeldi suspensiooni ultraheliga 3 korda 20 sekundi jooksul. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 16000 p/min 30 minutit jäi lahustumatute rakuvalkude fraktsioon settesse, lahustuv - supernatanti.

Sade (lahustumatu fraktsioon) suspendeeriti lüüsipuhvris (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,002 ruumala β-merkaptanooli) ja lisati võrdne (massi järgi) maht uureat. Pärast segamist hoiti seda veevannis +37 °C juures, kuni uurea oli täielikult lahustunud. Seda tsentrifuugiti kiirusel 12 000 p/min 30 minutit ja supernatant koguti. Rekombinantse valgu puhastamiseks kanti supernatant mikrokristallilise tselluloosiga kolonni (Perloza MT-200, lontosorb, Tšehhi Vabariik). Valgud elueeriti tselluloosist 8-2 M uurea ja 50 mM Tris-HCl lahusega (pH 8,0). Karbamiidi eemaldamiseks dialüüsiti proove öö läbi temperatuuril 25 °C PBS puhvriga.

Lahustuvat valgufraktsiooni kasutati immobiliseerimiseks süstitavale (amorfsele) tselluloosile. Supernatandile lisati 1/3 mahust 30% tselluloosi suspensiooni ja puhvrit, mis sisaldas 0,5% Triton X-100, 0,5 M NaCl; inkubeeriti temperatuuril 25 °C 1 h. Tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 8000 p/min, pellet resuspendeeriti samas puhvris; tselluloosi pesemist korrati 2 korda. Pellet resuspendeeriti PBS puhvris. Sorbendil immobiliseeritud olekus on valgud suspensioon.

Valkude kontsentratsioon vabas ja immobiliseeritud vormis määrati Bradfordi poolt lainepikkusel 595 nm. Tselluloosi protsendi määramiseks proovides, kus valgud olid immobiliseeritud sorbendile, viidi proovid kahe päeva jooksul lüofiliseerimisele, millele järgnes saadud masside ümberarvutamine. Nii saadi järgmised komplekspreparaadid (immunogeensed kompositsioonid) (Ag-CBD, Ag-CBD-tselluloos), mille puhtusaste oli vähemalt 95%.

Näide 4. Ag-CBD-tselluloosi kompleksi preparaatide immunogeensuse testimise meetod hiirtel.

I/St hiirte ja resistentsete A/Sn inbredhiirte liini emastele hiirtele (Tubercle Lung Dis, 2000, 80:15-25) manustati kahenädalaste intervallidega subkutaanselt järgmisi preparaate: -CBD-tselluloos (10 μg hiire kohta ESAT-6 sisalduse korral); 2) CBD-tselluloos (10 µg hiire kohta CBD sisalduse korral) – negatiivne kontroll; 3) üksik BCG vaktsiin (10 6 CFU hiire kohta) – positiivne kontroll. 5 nädala pärast hinnati IFN-gammat tootvate põrna T-lümfotsüütide sisaldust vastavate antigeenide juuresolekul kultiveerimisvedelikus ELISPOTiga, gamma-IFN-vastaste antikehadega reageerivate rakkude arvuga, 60 tundi. pärast kasvatamise algust. Tulemused on näidatud tabelis:

Tulemused näitavad, et CBD domeeni kaudu tselluloosiga seotud monoantigeenidega vaktsineerimine viib gamma-IFN-i tootjate spetsiifilise aktiveerimiseni. Vaktsineerimine samade antigeenidega, samades kogustes, kuid ilma tselluloosile adsorptsioonita, ei põhjusta immuunvastust (andmeid ei ole näidatud).

Näide 5. Meetod Ag-CBD-tselluloosi kompleksi preparaatide tuberkuloosivastase kaitsva toime testimiseks hiirtel.

C57BL/6 inbred hiired vaktsineeriti ESAT-6-CBD-tselluloosiga (10 ug hiire kohta ESAT-6 sisalduse alusel); CBD-tselluloos (10 µg hiire kohta CBD sisalduse korral – negatiivne kontroll; 1) soolalahus (negatiivne kontroll 2) kaks korda subkutaanselt, 2-nädalase intervalliga. 5 nädalat pärast teist vaktsineerimist nakatati hiirtele intravenoosselt 5 x 106 CFU virulentset tüve M. tuberculosis H37Rv. 4 nädalat pärast nakatamist tapeti igast rühmast 4 hiirt ning mükobakterite paljunemist kopsudes ja põrnas hinnati elundite homogenaatide külvamisega Dubos agarile, millele järgnes kolooniate loendamine. Ülejäänud hiirtel (igas rühmas 8) jälgiti ellujäämiskõverate määramist. Tulemused on näidatud joonisel 3. On kindlaks tehtud, et vaktsineerimine spetsiifiliste antigeenidega tselluloosi sorbendil vähendab oluliselt mükobakterite arvu elundites (joonis 3A, P<0,01, непарный тест Стьюдента) и продлевает срок жизни зараженных животных (Фиг.3Б, Р<0,01, критерий Гохана для кривых выживания).

Immuunvastuse parameetrite hindamine hiirtel:

CD4 + T-lümfotsüütide proliferatiivne aktiivsus in vitro testides;

IFN-gammat tootvate immuunsüsteemi rakkude arvu suurenemine immuniseerimise tulemusena;

Virulentsete mükobakterite arvu vähendamine nakatunud hiirte kopsudes ja põrnas;

Hiirte suurenenud elulemusaeg pärast nakatumist.

1. Rekombinantne plasmiid pESAT6-CBD, mida esindab nukleotiidjärjestus nr 1, mis tagab rekombinantse ESAT6-CBD valgu ekspressiooni, mis koosneb M. tuberculosis'e täispikast ESAT6 valgust, Gly-Ser speisser, tselluloosi siduv. A.thermophilum'i CelD endoglükanaasi geeni domeen, suurusega 4282 aluspaari n., mis koosneb järgmistest struktuurielementidest:
rekombinantse ESAT6-CBD valgu kunstlik bakteriaalne operon, sealhulgas: bakteriofaagi T5 varajase promootori promootorpiirkond (7-87 aluspaari), rekombinantse ESAT6-CBD valgu geen (117-1007 aluspaari), transleerimata transkriptsioon terminatsioonipiirkond (1047-1141 b.p.);
bakteriaalne beeta-laktamaasi operon, mis tagab resistentsuse ampitsilliini suhtes (3217-4067 aluspaari);
ColEl tüüpi bakteriaalne replikatsiooni initsiatsioonikoht (2474-2485 bp), mis tagab plasmiidi replikatsiooni E. coli tüvedes.

2. Rekombinantne E. coli M15 tüvi, mis on saadud E. coli M15 tüve transformeerimisel nõudluspunktile 1 vastava plasmiidiga, ESAT6-CBD valgu tootja.

3. Meetod rekombinantse ESAT6-CBD valgu saamiseks, immobiliseerimiseks, kontsentreerimiseks ja puhastamiseks tselluloosil, sealhulgas:
E. coli Ml5 tüve nr 2 rakkude kasvatamine;
ESAT6-CBD valgu immobiliseerimine E. coli M15 tüve rakuekstraktides tselluloosi sorbendil afiinsusinteraktsiooni tõttu inkubatsiooniprotseduuri ajal, millele järgneb pesemine seondumata bakteriaalsetest valkudest, samal ajal kui sihtprodukt kontsentreeritakse ja puhastatakse; sihttoote isoleerimine.

4. Rekombinantne ESAT6-CBD valk molekulmassiga 32,0 kDa (pI 5,05), sealhulgas täispikk ESAT6 valk järjestusega nr 2, Gly-Ser speisser järjestusega nr 3, tselluloosi siduv domeen A.thermophilum'i CelD endoglükanaasi geeni järjestusega nr 4.

5. Immunogeenne kompositsioon, mis sisaldab efektiivses koguses tselluloosile immobiliseeritud valku vastavalt nõudluspunktile 4 ESAT6-CBD, mis aktiveerib spetsiifiliselt gamma-IFN-i sünteesivaid T-lümfotsüüte, kui neid stimuleeritakse mükobakteriaalsete antigeenidega.

6. Meetod nõudluspunktile 5 vastava immunogeense kompositsiooni kaitsvate omaduste testimiseks seoses tuberkuloosiinfektsiooniga hiirte tuberkuloosimudelis, kaasa arvatud
a) inbredliini C57BL/6 hiirte vaktsineerimine kaks korda subkutaanselt 2-nädalase intervalliga järgmiste preparaatidega: 6. nõudluspunktile 5 vastav immunogeenne kompositsioon kiirusega 10 μg hiire kohta vastavalt toimeaine sisaldusele. aine; CBD-tselluloos kiirusega 10 μg hiire kohta CBD sisalduse korral – negatiivne kontroll 1; soolalahus – negatiivne kontroll 2;
c) infektsioon 5 nädala pärast. pärast hiirte teistkordset intravenoosset vaktsineerimist annusega 5,10 6 CFU virulentne tüvi M.tuberculosis H37Rv;
c) tapmine 4 nädala pärast. pärast nakatamist igast neljast hiirest koosnevast rühmast ja mükobakterite paljunemise hindamist kopsudes ja põrnas elundihomogenaatide külvamise teel Dubos agarile, millele järgneb kolooniate loendamine;
d) ülejäänud hiirte (8 rühma kohta) ellujäämiskõverate joonistamine, kusjuures nõudluspunktile 5 vastava immunogeense kompositsiooni kaitsvaid omadusi hinnatakse etappide c) ja d) tulemuste põhjal.

Sarnased patendid:

Leiutis käsitleb biotehnoloogiat ja käsitleb PDE4D geeni SNP41 alleeli A, samuti selle kasutamist diagnostilise markerina, et hinnata individuaalset eelsoodumust insuldi tekkeks Venemaa populatsioonis.