Molekulaardiagnostika täpsus PCR meetodil. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR diagnostika)

Polümeraasi meetod ahelreaktsioon e PCR-i kasutatakse enamiku laboridiagnostikas nakkushaigused. See võimaldab tuvastada uuritavas materjalis mikroorganismide geneetilist materjali ja seeläbi neid tuvastada.

Mis see on

Meetod töötati välja 1983. aastal ja 1993. aastal sai selle autor Mullis Nobeli preemia.

Meetodi põhitõed

Igal mikroorganismide, taime või looma tüübil on ainulaadne kromosoomide komplekt. Neid moodustab DNA - desoksüribonukleiinhape. Väikesi DNA fragmente nimetatakse nukleotiidideks ja nende spetsiifiline järjestus moodustab geeni. Iga geen kodeerib ühe valgu, näiteks kollageeni, albumiini ja kõigi teiste sünteesi. Nukleotiidjärjestus on ainulaadne. Iga elusorganismi liigi jaoks on ühised DNA lõigud, mis vastutavad selle liigi ühtsuse eest.

Uurimismaterjalis sisalduva mitmesaja mikroobi DNA analüüs liigimustreid ei paljasta. Oluliste geneetiliste komponentide arvu on vaja mitu korda suurendada, mis võimaldab neid tuvastada. See probleem lahendatakse PCR-meetodi abil.

Uurimistöö on seotud molekulaarbioloogia valdkonnaga. Mikroobsele DNA-le lisatakse DNA polümeraas ja vabad nukleotiidid. Polümeraas on ensüüm, mis tagab saadaolevatest nukleotiididest soovitud piirkonna mitu koopiat. Protsessi käivitavad praimerid - lühikesed riboahelad nukleiinhape(RNA), mis kinnitub soovitud geeni algusesse.

Analüüsiprotsess koosneb mitmest etapist, millest igaüks nõuab teatud aja- ja temperatuuri režiim. Tuhandikgrammist bakteri DNA-st saadakse mõne tunni jooksul analüüsiks vajalik kogus materjali. Kaasaegsed seadmed võimaldavad korduvalt kopeerida kasvõi ühe raku, näiteks sperma DNA-d.

Uuringu edenemine

Analüüsi sammud:

• patsiendilt bioloogilise materjali (veri, uriin, tupesekret, sülg jne) võtmine ja laborisse toimetamine;
• kahe DNA ahela eraldamine, mille põimumisel moodustub kromosoom, ja nende puhastamine võõrlisanditest;
• DNA ahela soovitud lõigu kahekordistumine, mille tulemusena selle kogus suureneb geomeetriline progressioon;
• saadud materjali töötlemine lahustega, mis põhjustavad saadud DNA fragmentide spetsiifilist luminestsentsi, selle värvimise abil tuvastatakse, milline bakter või viirus oli allikas; DNA fraktsioonide eraldamiseks kasutatakse elektroforeesi.

Analüüsi kestus on 4-5 tundi.

PCR-meetodi eelised

Polümeraasi ahelreaktsioonil on nakkusetekitajate tuvastamise traditsiooniliste meetoditega võrreldes järgmised eelised:

• mikroorganismi geenide otsene määramine, erinevalt selle vastaste antikehade tuvastamisest paljudes teistes identifitseerimismeetodites;
• spetsiifilisus, st teatud tüüpi patogeeni määramine;
• tundlikkus: diagnoosimiseks piisab isegi ühest mikroorganismi rakust; üldiselt on vajalik patogeeni kogus 10 korda väiksem kui muude meetodite puhul;
• biomaterjali mitmekülgsus - uuritakse mitte ainult verd, vaid ka tihedaid koerakke, epiteeli kraapimist, limaskesta sekretsiooni ja mis tahes muud keskkonda, kus võib esineda mikroob;
• tulemuste saamise kiirus on mitu korda suurem kui muude meetodite kasutamisel;
• võime ära tunda kroonilisi, loid ja varjatud infektsioone;
• patsiendilt võetud materjali desinfitseerimine ja laboritöötajate saastumise vältimine;
• uurimisprotsessi täielik automatiseerimine.

Analüüsi puudused

PCR-i puudused on peamiselt seotud selle tehnilise keerukusega:

• on vaja valida õiged RNA järjestused - praimerid ja valmistada ka nukleotiidide segu DNA sünteesiks;
• meetod on väga tundlik, nii et kui proov sisaldab erinevat tüüpi mikroobe, võib see anda valesid tulemusi;
• analüüsitud materjal on vaja hoolikalt puhastada inimese valkude ja ravimite lisanditest, kuna need vähendavad diagnoosi täpsust;
• Vigade ja saastumise kindlakstegemiseks on vajalik tulemuste kontrollvõrdlus proovidega, mis teadaolevalt sisaldavad või ei sisalda mikroobset materjali, aga ka ilma DNAta.

Valenegatiivsed PCR-tulemused on põhjustatud analüüsitehnika rikkumisest ja reaktsiooni mis tahes komponendi geneetilise järjestuse muutustest. Valepositiivsed andmed ilmnevad ka siis, kui praimerite ja muude kasutatud reaktiivide nukleotiidid langevad kogemata kokku ühe mikroorganismi geeniga.

Mikroorganismi eraldamine ei näita alati, et see oli haiguse põhjustaja. Inimese DNA analüüsimisel on veel üks probleem: geneetiline alus Enamik haigusi on siiani teadmata, mistõttu ei ole võimalik mittenakkuslikke patoloogiaid mikrobioloogilisel tasandil diagnoosida. See on suund meditsiiniline geneetika areneb väga aktiivselt.

Näidustused PCR testimiseks

Seda analüüsi kasutatakse järgmistes olukordades:

• vajadus avastada ja tuvastada viiruseid, baktereid, algloomi mis tahes nakkushaiguste korral, kui on vaja diagnostilist täpsust;
• isendi tuvastamine võrreldes teadaoleva päritoluga geneetilise materjaliga;
• peennõeltehnikas saadud kudede analüüs, mida on muude meetoditega väga raske uurida;
• leukeemia ja pahaloomuliste kasvajate diagnoosimine;
• katsete läbiviimine embrüonaalsete tüvirakkude siirdamisega loomadele (selliste rakkude kasutamine inimestel on keelatud), samuti eelnevalt kindlaksmääratud geneetilise haigusega laborihiirte aretusliinid.

PCR-reaktsiooni kasutamise väljavaated ja selle variatsioonid meditsiinis ja bioloogias haaravad kujutlusvõimet – alates uute ravimite testimisest geenitasemel kuni konkreetsete omadustega transgeensete organismide loomiseni. Sellesuunaline töö käib maailma suurimates laborites, mis aitab täiustada PCR meetodit rakendatud tasemel inimese nakkushaiguste diagnoosimisel.

Meditsiinis kasutatakse PCR-meetodit tavaliselt järgmiste haiguste diagnoosimiseks ja ravi efektiivsuse hindamiseks:

• intratsellulaarsed infektsioonid, näiteks või;
• sugulisel teel levivad haigused;
• Helicobacter pylori infektsioon ja paljud teised.

Ettevalmistus uuringuks

3 päeva enne analüüsi peate lõpetama alkoholi joomise. Mõned ravimid, näiteks antibiootikumid, katkestatakse vastavalt arsti ettekirjutusele.

Sugulisel teel levivate infektsioonide diagnoosimiseks ettevalmistamise reeglid:

• 2 päeva enne analüüsi lõpetage seksuaalvahekord;
• 2 tundi enne analüüsi mitte urineerida;
• ärge dušitage eelmisel õhtul ja hommikul; lihtsalt pesta soe vesi puhastusvahendeid pole;
• ärge võtke PCR-i ajal ja 4 päeva pärast seda (naistel).

Üldised ettevalmistusreeglid:

• 2 päeva ette välista intensiivne füüsiline harjutus, sport;
• uuringupäeva hommikul ärge suitsetage ega sööge toitu;
• kui materjal on võetud suust ja ninaneelust, ära pese hambaid hommikul.

Nende tegemisest lihtsad reeglid Selle täpse, kuid kalli diagnostikameetodi usaldusväärsus sõltub. Tulemuse sõltumatu tõlgendamine ei anna vajalikku teavet haiguse ja selle ravi kohta. Sellepärast peate pärast PCR-analüüsi andmete saamist konsulteerima arstiga.

Millise arsti poole peaksin pöörduma?

Sugulisel teel leviva haiguse kahtluse korral saadab günekoloog, uroloog, androloog või venereoloog teid PCR-le. Hepatiidi ja HIV-nakkuse uuringu määrab nakkushaiguste spetsialist ja tuberkuloosi puhul - ftisiaater. PCR-i kasutavad oma praktikas paljude erialade arstid, näiteks onkoloogid, hematoloogid, gastroenteroloogid ja geneetikud.

Inimesed hakkasid PCR-analüüsist esimest korda rääkima 1983. aastal. Selle tehnika töötas välja Kary Mullis ja tema labori liikmed. Sellest ajast peale on uuringu populaarsus pidevalt kasvanud, sest sellel on teiste meetodite ees märkimisväärne hulk eeliseid.

Tänapäeval on PCR-diagnostika etalon või standard infektsioonide ja patogeenide tuvastamisel, eriti nende puhul, mis on asümptomaatilised. Esiteks on see prekliiniline diagnostika.

Analüüsi läbiviimine PCR masinas

PCR analüüsi olemus seisneb selles, et teatud tüüpi patogeenile iseloomulikud nukleiinhappejärjestused (DNA või RNA) kloonitakse (suurendatakse kordades) katseklaasis.

Lühend PCR tähistab polümeraasi ahelreaktsiooni.

Kodu eristav tunnus selle meetodi puhul on võimendus, st. luues vajalikust geenist või selle fragmendist tohutu hulga koopiaid. Kõik see toodetakse väljaspool keha, s.o. in vitro.

Seega, kui viiakse läbi 20 PCR-tsüklit, saadakse umbes 1 miljon koopiat või rohkem. See võimaldab infektsiooni tuvastada ka siis, kui selle kogus lähtematerjalis on ebaoluline, kui muud analüüsimeetodid on jõuetud. See määrab selle meetodi kõrge tundlikkuse.

Lihtsamalt öeldes võite tuua järgmise analoogia: te ei märka põrandal ühte väikest liivatera, kuid pärast liivaterade arvu miljon korda suurendamist (PCR) on liivahunnik juba selgelt nähtav. .

Infektsioonide PCR-meetodiga testimise peamised eelised on:

• kõrgeim tundlikkus ja spetsiifilisus võrreldes teiste nakkusetekitajate tuvastamiseks kasutatavate meetoditega;
• võime tuvastada mikroorganisme mitmesugustes bioloogilistes materjalides (veri, uriin, tupe sekretsioon, sülg jne);
• võimalus samaaegselt tuvastada mitu põhjuslikku mikroorganismi, kui neid on. Võrdluseks, bakterioloogiliste meetodite kasutamine sellist võimalust ei anna, sest nõutav rakendus erinevad keskkonnad erinevate patogeensete mikroobide kasvatamiseks;
• bioloogilise materjali transportimise võimalus, sest Haigustekitaja tuvastamiseks ei ole vaja seda elus hoida;
• analüüsi kiirus;
• etioloogilise diagnoosi täpsus;
• patogeenide kvantitatiivse määramise võimalus - eriti oluline oportunistlike mikroobide jaoks, mis alles pärast teatud kontsentratsiooni saavutamist on võimelised haigust põhjustama;
• võime kontrollida nakkusprotsessi kulgu ravi ajal.

Infektsioonide PCR analüüs

Praegu määratakse suurem osa sugulisel teel levivatest (ja muudest) nakkushaigustest polümeraasi ahelreaktsiooni meetodil. Diagnostika on oma kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisuse tõttu muutunud laialt levinud.

Eriti populaarne on klamüüdia PCR-analüüs.

See on tingitud asjaolust, et need mikroorganismid elavad rakusiseselt, mis tekitab teatud raskusi nende tuvastamisel.

PCR-diagnostika võimaldab tuvastada isegi minimaalse koguse klamüüdiat, mis reeglina ei põhjusta veel kliiniliste sümptomite ilmnemist. Isegi ainult 2 nukleiinhappemolekuli olemasolu uuritavas materjalis võimaldab tuvastada põhjustava infektsiooni.

Ja see on eduka ravi võti, mis algab prekliinilises staadiumis.

Samuti määratakse infektsioonid:

• viiruslik hepatiit;
• tuberkuloos;
• puukentsefaliit;
• mitmesugused sugulisel teel levivad haigused jne.

PCR-diagnostika võimaldab teil lahendada mitmeid muid olulisi probleeme:

• teraapia jälgimine ja selle efektiivsuse hindamine;
• "viiruse koormuse" määramine, mille alusel valitakse ravimi individuaalne annus;
• farmakoloogiliselt resistentsete (ravimite suhtes mittetundlike) mikroorganismide tüvede tuvastamine.

Testiks valmistumine

Testiks pole vaja spetsiaalselt ette valmistuda, see viiakse läbi PCR meetodil. Siiski on väga oluline, et spetsialist koguks materjali kõiki nõudeid järgides vajalikud tingimused steriilsus.

Nii et näiteks vere võtmiseks tuleks kasutada spetsiaalseid vaakumsüsteeme, suguelundite sekreedi võtmiseks spetsiaalseid torusid jne.

Mõnel juhul tuleb materjal transportida laborisse. Selle korrektseks tegemiseks on vaja anum hermeetiliselt sulgeda bioloogilise materjaliga. See hoiab ära teiste väliskeskkonnas elavate mikroorganismide tungimise.

PCR-analüüsi tulemused võivad olla kaks võimalust:

• positiivne – tuvastatud patogeen;
• negatiivne – patogeeni ei ole tuvastatud.

Te peaksite teadma, et isegi kliiniliste sümptomite puudumisel on võimalik saada positiivne tulemus.

Sel juhul on vaja keskenduda polümeraasi reaktsiooni andmetele, sest see võimaldab tuvastada haigust prekliinilises staadiumis.

Mõnikord võib küsitava vastuse saada siis, kui tuvastatud koopiate arv vastab normi ülemisele piirile. Haiguse põhjuse selgitamiseks tuleks analüüsi korrata, pöörates erilist tähelepanu bioloogilise materjali kogumise tingimustele.

Kui täpne on PCR diagnostika?

PCR-diagnostika peamised eelised võib sõnastada mitme teesi kujul:

• võimalus saada tohutul hulgal patogeensete mikroorganismide koopiaid;
• suur koopiate arv on eduka järjestuse (tuvastuse) võti.

See tagab PCR analüüsi suure täpsuse rakusiseste patogeenide ja aeglaselt kasvavate mikroorganismide tuvastamiseks.

Seetõttu on meetod eriti informatiivne tuberkuloossete mükobakterite ja muude sarnaste nakkusetekitajate tuvastamiseks. Sellel on suurim täpsus ja see ei pea saadud tulemusi üle kontrollima (v.a. juhud).

Kõige usaldusväärsemate tulemuste saamiseks on vaja täita kaks põhitingimust, mis takistavad eksogeenset (välist) nakatumist:

• õige materjali valik;
• õige transport.

Sait pakub taustainfo ainult informatiivsel eesmärgil. Haiguste diagnoosimine ja ravi peab toimuma spetsialisti järelevalve all. Kõigil ravimitel on vastunäidustused. Vajalik on konsultatsioon spetsialistiga!

Millistes meditsiinivaldkondades seda meetodit kasutatakse?

• Geenide isoleerimine ja kloonimine.
• Diagnoosige geneetilisi ja nakkushaigusi.
• Tehke kindlaks isadus. Laps pärib osa oma geneetilistest omadustest oma bioloogilistelt vanematelt, kuid tal on oma ainulaadne geneetiline identiteet. Mõnede vanemate geenidega identsete geenide olemasolu võimaldab rääkida suhte loomisest.

Kuriteopaigal koguvad kohtumeditsiini teadlased geneetilise materjali proove. Nende hulka kuuluvad: juuksed, sülg, veri. Seejärel saab tänu polümeraasi reaktsioonitehnikale amplifitseerida DNA-d ja võrrelda võetud proovi identiteeti kahtlustatava geneetilise materjaliga.

Polümeraasi ahelreaktsiooni kasutatakse meditsiinis tõhusalt:

• Pulmonoloogilises praktikas - kopsupõletiku, tuberkuloosi bakteriaalsete ja viiruslike tüüpide eristamiseks.
• Günekoloogilises ja uroloogilises praktikas - ureaplasmoosi, klamüüdia, mükoplasma infektsiooni, gardnerelloosi, herpese, gonorröa määramiseks.
• Gastroenteroloogilises praktikas.
• Hematoloogias - onkoviiruste ja tsütomegaloviiruse infektsiooni määramiseks.
• Nakkushaiguste, nagu viirushepatiit, difteeria, salmonelloos, ekspressdiagnoos.

Praegu kõige levinum seda meetodit nakkushaiguste diagnoosimisel ( viirusliku etioloogiaga hepatiit, HIV, sugulisel teel levivad haigused, tuberkuloos, puukentsefaliit).

Mis juhtub reaktsiooni ajal?

Polümeraasi reaktsioon võimaldab tuvastada infektsiooni isegi siis, kui bioloogilist materjali sisaldav proov sisaldab ainult ühte või mitut patogeeni DNA molekuli.

Reaktsiooni käigus toimub tänu ensüümile DNA polümeraasile kahekordistumine ( replikatsioon) DNA osa. Desoksüribonukleiinhape ise ( lühendatult DNA) on meie jaoks oluline, kuna tagab geneetilise informatsiooni talletamise ja edasikandumise tütarrakkudesse. DNA-l on spiraali kuju, mis koosneb korduvatest plokkidest. Need plokid moodustavad nukleotiide, mis on väikseim osake DNA. Nukleotiidid moodustuvad aminohapetest.

DNA lõikude replikatsiooniprotsess toimub korduvate tsüklite ajal. Igas sellises tsüklis ei kopeerita ja kahekordistatakse mitte ainult algset DNA fragmenti, vaid ka neid fragmente, mida juba eelmises amplifikatsioonitsüklis kahekordistati. Kõik see sarnaneb geomeetrilise progressiooni protsessiga.

Olemas:

• Loomulik võimendus ( see tähendab DNA kopeerimise ja paljundamise protsessi), mis esineb meie kehas ja on deterministlik, ettemääratud protsess.
• Kunstlik amplifikatsioon, mis tekib polümeraasi ahelreaktsiooni tõttu. Sel juhul kontrollitakse kopeerimisprotsessi ja see võimaldab isegi lühikesi nukleiinhappelõike dubleerida.

Pärast kolmekümne kuni neljakümne tsüklit ulatub fragmentide arv mitme miljardini.

Võimendamiseks in vitro (in vitro) on vajalik, et spetsiifiline võõr-DNA fragment ( see tähendab, et DNA ei ole patsiendi, vaid patogeeni oma). Kui loodud lahus ei sisalda konkreetset fragmenti, ei toimu polümeraasi toimel ahelreaktsiooni. See seletab PCR kõrge spetsiifilisuse fakti.

PCR diagnostika etapid

6. Elektroforeesi sooritades summeeritakse tulemused ja arvutatakse kahekordistustulemused.

Millised on selle diagnoosi eelised?

• Mitmekülgsus: selle meetodi jaoks sobivad kõik nukleiinhappeproovid.
• Kõrge spetsiifilisus: patogeenil on ainulaadsed DNA ahelate järjestused, mis on talle spetsiifilised. Seetõttu on PCR tulemused usaldusväärsed, on võimatu segi ajada ühe patogeeni geeni teise patogeeni geeniga.
• Tundlikkus isegi ühe patogeeni molekuli olemasolu suhtes.

• Uurimiseks vajalik väike kogus materjali. Isegi tilk verd sobib. Võimalus saada tulemusi minimaalse proovimahu abil on väga oluline pediaatrilistes, neonatoloogilistes, neuroloogilistes uuringutes, aga ka kohtumeditsiini praktikas.
• Võimalus määrata loid, krooniline infektsioon, mitte ainult äge.
• Paljusid patogeenseid kultuure on väga raske in vitro kultiveerida, kasutades muid meetodeid ja polümeraasi reaktsioon võimaldab paljundada saaki vajalikus koguses.

Millised puudused sellel diagnoosil on?

• Kui PCR-i jaoks mõeldud materjal sisaldab mitte ainult elava, vaid ka surnud patogeeni DNA-d, toimub mõlema DNA amplifikatsioon. Sellest tulenevalt ei pruugi pärast diagnoosi määratud ravi olla täiesti õige. Mõne aja pärast on parem jälgida ravi efektiivsust.
• Mingil moel võib puuduseks pidada ka suurenenud tundlikkust mikroorganismide esinemise suhtes. Lõppude lõpuks sisaldab inimkeha tavaliselt oportunistlikku mikrofloorat, see tähendab, et need on mikroorganismid, mis elavad soolestikus, maos ja mujal. siseorganid. Need mikroorganismid võivad inimesele kahju tekitada ainult teatud ebasoodsate tingimuste – mittevastavuse korral hügieeninõuded, saastunud joogivesi jne. PCR-meetod võimendab isegi nende mikroorganismide DNA-d, kuigi need ei põhjusta patoloogiat.
• Erinevate katsesüsteemide PCR võib näidata tulemusi, mis erinevad üksteisest. Sellel tehnikal on palju modifikatsioone: " pesastatud», « asümmeetriline», « tagurpidi», « kvantitatiivne» PCR ja teised.

Kaasaegsed kõrgtehnoloogilised meetodid laboriuuringud võimaldab tuvastada haigusi varases staadiumis. Nakkushaigused arenevad ja arenevad, neid on üha rohkem ja neid on üha raskem tuvastada. Diagnostika PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) meetodil on üks uusimaid ja täpsemaid. Selle arendamise eest pälvis teadlane Kary Mullis Nobeli preemia.

Polümeraasi ahelreaktsioon– molekulaargeneetilise diagnostika meetod, mis võimaldab leida inimestel erinevat tüüpi nakkuslikke ja pärilikke patoloogiaid nii ägedate kui krooniline vorm, ja ammu enne, kui patoloogia hakkab avalduma. Enamik arste puutub selle analüüsiga kokku iga päev ega suuda enam ette kujutada, kuidas ilma selleta on võimalik teha õige diagnoos ja haiguse staadium.

PCR-i diagnostika olemus

PCR analüüsis kasutatakse molekulaarbioloogia põhimõtteid. See kasutab spetsiaalseid ensüüme, mis kopeerivad korduvalt RNA ja DNA fragmente, samuti haigusi põhjustavaid mikroorganisme, mida leidub inimese bioloogilistes materjalides. Kopeerimine toimub mitmes etapis, seega moodustub ahelreaktsioon. Pärast seda võrdlevad laborispetsialistid saadud andmeid ühise andmebaasiga ning tuvastavad haiguse tekitajad ja nende kontsentratsiooni. Diagnoos viiakse läbi spetsiaalne seade, mis jahutab ja soojendab katseklaasi biomaterjaliga ja mida nimetatakse termotsükleriks. Temperatuurirežiimi järgimine mõjutab analüüsitulemuste õigsust.

Mikroorganismide DNA fragmente võivad sisaldada järgmised bioloogilised materjalid:

• bioloogilised vedelikud;
• veri ja selle derivaadid;
• epiteelirakkude kraapimine või määrimine;
• uriin;
• röga;
• lima ja muud bioloogilised eritised;
• limaskesta biopaatiad seedetrakti.

Kus kasutatakse PCR diagnostikat?

Nakkushaiguste diagnoosimise võimalused polümeraasi ahelreaktsiooni abil on suured, seda saab kasutada mitmesuguste infektsioone põhjustavate viiruste tuvastamiseks, näiteks:

Ei ole täielik nimekiri haigused, mis tuvastatakse PCR-analüüsi abil. Enamik neist patoloogiatest on varajases staadiumis on praktiliselt märkamatud, kuid nende mõju tagajärjed organismile on äärmiselt negatiivsed ja sageli ohtlikud inimeste tervisele ja elule.

Rasedatele määratakse sugulisel teel levivate infektsioonide tuvastamiseks PCR-analüüs, mis suurendab oluliselt emakakaelavähi riski ning avaldab kahjulikku mõju raseduse kulgemisele ja lapse tervisele. Seetõttu on suguhaiguste diagnoosimine äärmiselt oluline, et vältida loote nakatumist patogeensete mikroorganismidega.

Kõige eelneva põhjal võime järeldada, et laboratoorne diagnostika PCR-meetodi kasutamine aitab arstil määrata täpse diagnoosi ja määrata igal üksikjuhul tõhusa ravi.

See on huvitav! Lisaks meditsiinile kasutatakse PCR meetodit ka muudes valdkondades, näiteks kohtuekspertiisis, kui on vaja tuvastada, kellele kuulub kuriteopaigalt leitud biomaterjal ning mõnikord kasutatakse PCR-i ka isaduse määramiseks, katsete läbiviimiseks. DNA mutatsioonid ja muud katsed.

Meetodi plussid ja miinused

PCR-diagnostika eelised on järgmised:

• testi kõrge tundlikkus võimaldab tuvastada isegi üksikuid patogeeni tekitajaid, mis võimaldab tuvastada patoloogiat varases staadiumis, kroonilistes ja varjatud vormides;
• meetodi mitmekülgsus võimaldab uuringutes kasutada peaaegu kõiki biomaterjale süljest naharakkudeni;
• suur katvus - ühe proovi uurimisel on võimalik määrata mitme erineva patogeeni olemasolu;
• täpsus - kõrge tase See uurimismeetod võimaldab teil mitte anda valenäitajaid;
• kiirus - tulemus on valmis keskmiselt viie tunniga, see tähendab, et patsient saab järeldusele järele tulla järgmisel päeval pärast biomaterjali esitamist;
• suhteliselt madal hind- see diagnostiline meetod ei erine teistest kuludest laboratoorsed uuringud veri;
• Seda meetodit kasutades saab teha prekliinilist ja retrospektiivset diagnostikat. Esimene tuvastab patogeensed mikroorganismid juba enne haiguse algust ja teine ​​​​viiakse läbi pärast patoloogia läbipõdemist, mis võimaldab vältida patoloogia arengut ja õigeaegselt ravida, samuti määrata haiguse varjatud vorm. haigus, mis ilmneb ilmsete sümptomiteta.

Kuid täiuslikke diagnostilisi meetodeid pole, seega on PCR-il ka puudusi:

• kõrged nõuded tehnoloogilise protsessi järgimisele;
• kõrged nõudmised laboritehnikute professionaalsusele.

Nõuanne! Parem on selline analüüs läbi viia ainult parimates ja professionaalsemates laborites, kus on rakendatud rangeid kvaliteedikontrollisüsteeme.

Tulemuste usaldusväärsuse tagamiseks on vaja järgida analüüsiks ettevalmistamise reegleid:

• sülje annetamisel ei tohi süüa ega juua ravimeid neli tundi enne protseduuri, peate loputama suud keedetud veega, seejärel tegema väikese nahamassaaži, et sekretsioon näärmest vabastada;
• Uriini kogutakse tavaliselt kodus. Enne seda on vaja pesta genitaale ja koguda 50 ml esimest hommikust uriini spetsiaalsesse anumasse, menstruatsiooni ajal ei ole soovitatav materjali koguda;
• Enne sperma loovutamist ei tohi mees kolm päeva seksuaalvahekorda astuda, saunas käia, kuuma vanni võtta, alkohoolseid jooke ega vürtsikat toitu võtta. Vahetult enne analüüsi on kolm tundi keelatud urineerida;
• Urogenitaalse määrdumise võtmiseks on soovitatav kolm päeva mitte olla seksuaalvahekorras. Kaks nädalat enne testi on antibakteriaalsete ravimite võtmine keelatud. Nädalaks peate lõpetama intiimgeelide, salvide, vaginaalsete ravimküünalde ja douching'i kasutamise. Kolm tundi enne biomaterjali võtmist peate hoiduma tualetti minemast.
• Veri loovutatakse hommikul tühja kõhuga.

Diagnostika materjali tuleks koguda tingimustes, mis väldivad selle saastumist, kuna see võib oluliselt mõjutada PCR-i tulemuse õigsust.

Analüüsi ärakiri

Test võib näidata positiivset või negatiivset tulemust. Negatiivne tähendab, et organismis pole nakkuskahtlust ja inimene on terve. Positiivne ütleb, et patsient on haige ja vajab ravi. Arst peab kõik näitajad dešifreerima ja väljendama. Te ei tohiks olla ärritunud ega karta halbu tulemusi, nende põhjal on peamine asi mitte edasi lükata ja mitte ise ravida.

Kas teile meeldis meie artikkel? Jaga sõpradega sotsiaalmeedias. võrgud või hinnake seda postitust:

(Hinnuseid veel pole)

Olen üldarst, üldarst. Minu pädevusse kuuluvad patsientide varajase diagnoosimise ning paljude seedetrakti-, kopsu- ja hingamisteed, maks, neerud, südame-veresoonkonna ja urogenitaalsüsteemid, nahahaigused, ainevahetushäired jne 15 aastat üldarsti kogemust Moskva kliinikutes, millest 5 töötas ühes Peterburi haiglas.. Vastan meeleldi küsimustele minu lugejate blogist.

PCR on infektsioonide diagnoosimine, kaasaegne ja ülitäpne viis erinevate nakkushaiguste avastamiseks. Kuidas see erineb teistest analüüsidest?

See lühend tähistab "polümeraasi ahelreaktsiooni". Wikipedia andmetel leiutas selle 1983. aastal Ameerika teadlane Kary Mullis. Ta sai oma avastuse eest Nobeli preemia.

Mõnda aega kasutati PCR-i ainult aastal teaduslikel eesmärkidel, mille järel meditsiin seda edukalt laenas. Uuringu põhiolemus on nakkustekitaja äratundmine DNA ja RNA tasemel. Iga patogeen, sisenedes DNA-sse, muudab oma struktuuri vastavalt teatud tüübile. Just muutunud DNA ilmumisega saab laborandile selgeks, milline haigus inimkehas peidus on. PCR-i muud eelised on järgmised:

1. DNA-sse "jäljed" jätnud nakkuse algpõhjuse tuvastamine. Mitme haiguse kombineerimisel on raske kindlaks teha seda, millest see kõik alguse sai. Ja selleks õige seadistus diagnoosimine ja valik tõhus ravi, on ahelreaktsioonil tohutu tähtsus;
2. PCR tuvastab mitte ainult muutunud DNA, vaid ka konkreetse transformatsioonikoha. See on vajalik valeinfektsioonide kahtluste kõrvaldamiseks;
3. PCR diagnostika on nii tundlik, et tuvastab isegi üksikud bakterid ja viirused. Need võivad jääda verre pärast valesti määratud ravi või planeerimata ravimite katkestamist. Minimaalne diagnostiline kogus kl PCR dekodeerimine- 10 patogeeni rakku. Muud testimismeetodid ei ole nii tõhusad;
4. Patogeensed mikroorganismid tuvastatakse isegi siis, kui STD-i väljendunud sümptomid puuduvad. Kui selline haigus avastatakse varases staadiumis, ei võta selle ravi nii kaua aega kui selle kaugelearenenud vormid;
5. Patsient saab PCR tulemused üsna kiiresti. Infektsioonide diagnoosimiseks kulub mitte rohkem kui 4-6 tundi. Koos dekrüpteerimisega ei kesta kogu protsess rohkem kui 1-2 päeva;
6. Ühekordsest DNA materjalist piisab 5-6 proovi tegemiseks. Patsient ei pea mitu korda määrima;
7. PCR ja infektsioonide uurimine ei seisa paigal, see valdkond areneb pidevalt. Leiutatakse uusi kõrgendatud tundlikkusega katsesüsteeme ja uuringute läbiviimise kulusid vähendatakse. Kui varem oli see saadaval ainult megalinnade elanikele, siis nüüd ei kujuta piirkondade statsionaarsete kliinikute arstid ette haiguse tuvastamist ilma selleta.

PCR-meetodi omadused:

1. Täpsus (vead on minimaalsed ja nende sagedus ei ületa 0,01%);
2. Tundlikkus (test "arvutab" välja üksikud bakterid veres ja määrdudes);
3. Spetsiifilisus (PCR tuvastab infektsioonid, mis sageli ei avaldu üldse enne rasket staadiumi);
4. Unikaalsus (testid on tõhusad olukordades, kus teised uuringud midagi ei leia).

PCR analüüsi tulemused

Kuidas ahelreaktsiooni meetod töötab, kuidas valmistuda analüüsiks?

Laboris toimuv ahelreaktsioon hõlmab DNA ja RNA erinevate osade korduvat reprodutseerimist, et leida üles väga katkendlik lüli. Happeid amplifitseeritakse (kahekordistatakse) ensüümpreparaatide abil. Ensüümide abil saab laboritehnik piisava arvu patogeense DNA piirkonna koopiaid, et võrrelda selle PCR-i teatud infektsioonist põhjustatud haiguste proovidega.

Tavaliselt kasutatakse bioloogilisi materjale, mis on võetud proovide või tampooniga. Identifitseerimiseks (sugulisel teel levivate infektsioonide dešifreerimiseks) võetakse tupest, emakakaelast või ureetrast PCR-i määr. Mõnikord kasutatakse ka uriini.

Hepatiidi, toksoplasmoosi või HIV esinemise kinnitamiseks või ümberlükkamiseks võetakse veenist verd. Sõrmetorkimisega kogutud veri annab sageli valenegatiivseid tulemusi. Mononukleoos diagnoositakse pärast materjali kogumist neelust. Tuberkuloosi saab tuvastada pärast röga kogumist, mida hommikul patsientidelt rikkalikult eraldub.

Tupest ja emakakaelast määrdumine PCR-i jaoks on lihtne test, mida te ei peaks kartma. 2-3 päeva enne seda peate seksuaalsest tegevusest loobuma. Samal ajal on isikliku hügieeni eesmärgil keelatud kasutada aluselisi geele ja seepe. Saate pesta tavalise sooja kraaniveega. Viimane pesu on õhtul enne hommikust laborisse või arsti vastuvõtule minekut.

Samuti on soovitatav lõpetada soori ravimine kreemide, salvide, suposiitide või pihustitega, kui seda tehakse. Määrimine võetakse esimestel päevadel pärast menstruatsiooni või vahetult pärast seda. Täpsemate tulemuste saamiseks on soovitatav 2-3 tundi enne PCR-määri võtmist tualetti mitte külastada.

Meestel võetakse ahelreaktsiooni jaoks tampooni ureetrast. Bioloogiline materjal kogutakse steriilse sondi või vatitikuga, mis on sisestatud ureetrasse. Protseduuri ajal võite tunda kerget ebamugavustunnet või põletustunnet. Ka mehed peavad ajutiselt loobuma seksist ja hügieenitoodetest. Nädal enne analüüsi lõpetatakse ravi antibiootikumide ja muude ravimitega. Kui pärast kogumist ebamugavustunne püsib, on soovitatav võimalikult kiiresti pöörduda kliiniku poole.

Oletame, et uuringus kasutatakse verd või patsiendi suguelunditest võetud tampooni. Geneetiline materjal asetatakse PCR-võimendisse ja sinna lisatakse ensüüme. DNA-d kuumutatakse temperatuurini 90–95 °C, kuni ahel on katkenud mitmeks lüliks. Seda protsessi nimetatakse denatureerimiseks. Reaktori töö käigus luuakse ühest DNA ja RNA proovist tuhandeid selle tulemuse analüüsimiseks (reaktsiooni dekodeerimiseks) sobivaid koopiaid.

PCR diagnostika tulemused

Ahelreaktsioon näitab mitte ainult nakkuse olemasolu, vaid ka patogeenide täpset arvu. Areng Viimastel aastatel- mutatsioonigeenide kunstlik sisestamine inimese DNA-sse, et tuvastada eelsoodumus genotüübi muutumiseks.

Mida näitab infektsioonide PCR-diagnoos?

Analüüsi tulemuste ärakirja vaatab tavaliselt raviarst eraldi läbi. Ahelreaktsiooni võimalused võimaldavad teil kinnitada või ümber lükata järgmiste haiguste esinemist:

Nagu sellest loendist selgub, annab PCR-diagnostika paljude spetsialiseeritud erialade arstidele piiramatud võimalused. Meetodit saab kasutada pulmonoloogias, viroloogias, infektoloogias, onkoloogias, gastroenteroloogias, hematoloogias, günekoloogias ja uroloogias.

PCR dekodeerimine: tulemused

Ahelreaktsiooni teste hindavad ainult arstid iga patsiendi kohta eraldi, võttes arvesse olemasolevaid patoloogiaid ja kroonilisi haigusi. PCR analüüside tulemused näitavad, nagu eespool mainitud, patogeensete bakterite kvantitatiivseid omadusi. Nendega konsulteerides määrab arst kindlaks haiguse raskusastme ja staadiumi. Nende näitajate põhjal määratakse hiljem ravimite annus ja ravikuuri kestus.

Negatiivne PCR tulemus tähendab, et kogutud bioloogilises materjalis ei esine viiruseid ega infektsioone. Positiivne PCR on häiresignaal. See tähendab, et patsiendi veres ja teistes bioloogilistes vedelikes on tuvastatud infektsioon.

Kui väärtused on minimaalsed, võib see viidata haiguse lihtsale kandmisele, mitte ainult haiguse aktiivsele arengule. Arst peaks pidevalt jälgima lihtsat nakkuse kandjat, mis tuvastatakse ainult PCR abil, kuid kellel ei ole muid sümptomeid.

Oluline on mitte paanikasse sattuda ja seda meeles pidada enamik teadusele teada viiruseid saab ravida antibakteriaalsete ravimitega. Ainult kvalifitseeritud spetsialist, kellel on konkreetse haiguse ravis kogemusi, saab need valida ja asendada teisega, kui need on ebaefektiivsed.

PCR-i dekodeerimist saab läbi viia mitte ainult arsti nõudmisel, vaid ka omal äranägemisel. Sageli teevad seda lähiajal rasedust planeerivad naised, et veenduda sugulisel teel levivate haiguste puudumises. Piirkonna konsultatsioonile registreerudes peab rase naine seda tüüpi diagnoosi siiski läbima.

PCR on kohustuslik naistele, kellel on olnud mitu aborti või raseduse katkemist erinevatel põhjustel. Enne IVF-i tehakse analüüs, et kõrvaldada kõik viljastatud munaraku võimaliku tagasilükkamise põhjused.

Mehed kipuvad PCR-i läbi viima pärast puhkust, mille jooksul oli puhkuseromaan või isegi mitu. Diagnostika aitab neil mitte seada ohtu oma elu ja potentsiaalsete seksuaalpartnerite tervist.

Sageli muutub PCR patsiendi jaoks ainsaks võimaluseks haigusest vabaneda esialgne etapp kui tüsistuste ja raske kulgemise risk on tühine.